Информации

Толкување на анализа на деполаризација/калциум на FURA

Толкување на анализа на деполаризација/калциум на FURA



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Направив експеримент за деполаризација што спореди лажна клеточна линија третирана со третирана линија. Еден дел од резултатите се лесни за толкување: Третманот резултираше со пониски соодноси 350/380 по должината на кривата на одговор. Тоа е лесно, третманот веројатно го намали транспортот на калциум. Меѓутоа, како дополнување на ова, третманот, исто така, значително го помести секој флексија во кривата порано по број на циклуси. Како може да се протолкува ова?


Толкување на анализа на деполаризација/калциум на ФУРА - психологија

Двонасочно сигнализирање помеѓу рецепторот на јанодин тип 1 (RyR1) и дихидропиридин рецепторот (DHPR) во скелетните мускули служи како истакнат пример за конформациона спојка. Неодамна беа презентирани докази за физиолошки механизам дека по деполаризација на миотубите цврсто се поврзуваат три калциумови канали, DHPR, RyR1 и канал за влез Ca 2+ со својства слични на SOCC (Чередниченко, Г., Хурн, А.М., Фесенден, Ј.Д.) , Ли, ЕХ, Ален, ПД, Бим, КГ и Песа, ИН (2004) Прок. Натл. Акад Наука САД. 101, 15793-15798). Оваа форма на конформациона спојка, наречена влез на калциум поврзан со побудување (ECCE) е предизвикана од α1s-DHPR сензор за напон и е многу зависен од RyR1 конформацијата. Во овој извештај, ние ги заменуваме цистеините RyR1 4958 или 4961 во рамките на ТXМотивот CFICG, заеднички за сите канали ER/SR Ca 2+, со серин. Кога се изразени во скелетни миотуби, C4958S- и C4961S-RyR1 правилно ја таргетираат и враќаат струјата од типот L преку DHPR. Меѓутоа, овие мутанти не реагираат на RyR активаторите и не поддржуваат скелетен тип EC спојка. Како и да е, деполаризацијата на клетките што изразуваат C4958S- или C4961S-RyR1 предизвикува влез на калциум преку ECCE што наликува на онаа за дивиот тип RyR1, освен за значително забавена кинетика на инактивација и деактивирање. ECCE во овие клетки е потполно независно од исцрпување на залихите, прикажува селективност на катјони на Ca 2+ & gtSr 2+ ∼Ba 2+ и е целосно инхибирана од SKF-96365 или 2-APB. Мутација на други не-ЦXXЦ мотивите цистеини во рамките на трансмембранскиот склоп RyR1 (C3635S, C4876S и C4882S) не го повторија фенотипот забележан кај C4958S- и C4961S-RyR1. Оваа студија ја покажува суштинската улога на Cys 4958 и Cys 4961 во рамките на непроменливата ЦXXC мотив за стабилизирање на конформациите на RyR1 кои влијаат и на неговата функција како канал за ослободување и на неговата интеракција со ECCE каналите.

Оваа работа беше поддржана од Националните институти за здравствени грантови 2P0 AR17605, 1P0ES11269 и 2R01 AR43140. Трошоците за објавување на овој напис делумно се покријат со плаќање на трошоци за страница. Затоа, овој напис мора да биде означен со ова „реклама“Во согласност со 18 U.S.C. Дел 1734 само за да го посочи овој факт.

Двајцата автори дадоа еднаков придонес за ова дело.

Сегашно обраќање: Оддел за фармакологија, Универзитет во Вашингтон, Сиетл, WA 98195.


Материјали и методи

Хетеролошка експресија на HCN канали. Човечки HCN4 субклонирани во ХинdIII/XbaВеб -страниците во pcDNA1.1/Amp векторот беше великодушно обезбеден од U. B. Kaupp (Forshungszentrum Julich, Германија). HEK293 клетките се одгледуваат во DMEM, дополнети со 10% FBS, 100 единици/ml пеницилин и 100 μg/ml стрептомицин. Кога клетките се приближиле кон сливот, тие биле засадени во садови од 35 мм и последователно биле трансфектирани со HCN плазмидот со употреба на метод на калциум фосфат. HCN4 беше котрансфектиран со GFP за да го води изборот на клетки што изразуваат HCN канали. По 48-96 часа, трансфектираните клетки со зелена флуоресценција беа избрани за експерименти со лепенка за стегање.

Клеточна дисоцијација. Адреналните хромафински клетки од стаорци Вистар (SLACCAS Inc., Шангај) беа изолирани и култивирани како што е опишано (26, 27). Клетките се користеа во експериментите по 2-6 дена во културата.

ДРГ невроните беа изолирани како што е опишано со мала измена и се користат 4-16 часа по подготовката (28). Користевме неврони со мала до средна големина (25-40 μm).

Употребата и грижата за животните користени во оваа студија беа во согласност со упатствата на Советодавниот комитет за истражување на животните на Шангајските институти за биолошки науки.

Електрофизиологија. Јонските струи беа проучувани во конфигурацијата на целата ќелија под стегач со напон со помош на засилувач EPC-9 (HEKA Electronics, Ламбрехт/Пфалц, Германија). За префрлување надворешни решенија, ние користевме систем за перфузија RCP-2B, кој има брзо размена на време (100 ms), контролирана електронски помеѓу седум канали (Инбио, Вухан, Кина ref. 28).

Решенијата што се користат за експерименти се сумирани во табелите 1 и 2. Отпорноста на пипета беше 2-5 MΩ за клетките на човечкиот ембрионален бубрег (HEK), невроните на ДСГ и клетките на надбубрежните хромафини.

Состав на внатрешни решенија* (во мм)

Експериментите за калибрација на флуоресценција беа изведени во сферични надбубрежни хромафински клетки, со дијаметар од 12-15 μm. Интрацелуларен раствор кој содржи висок CsCl (види Табела 1) се користеше за мерење на Ca 2+ струи со напон.

Мерењата на капацитетот на мембраната беа извршени со софтверски засилувач за заклучување на пулсовиот софтвер кој го контролира засилувачот EPC-9 (HEKA Electronics ref. 28). Симулирани акции потенцијални рафали за стимулација беа конструирани од компјутер од шаблон за потенцијален акција, кој беше однапред снимен од невронот на ДСГ под моменталната стегалка. Овој акционен потенцијал (АП) -стимулациска бранова форма беше применет на ДСГ невроните под целото клеточно напонско стегање.

DMEM и FBS беа купени од GIBCO. Солта Фура-2 е од Молекуларни сонди. Сите други хемикалии беа од Сигма. Сите експерименти беа спроведени на собна температура (22-24 ° C).

Мерења на флуоресценција и теорија на фракционо Ca 2 + Мерења. Интрацелуларен калциум ([Ca 2+]јас) беше измерено со користење на систем за сликање Ca 2+ (TILL Photonics, Planegg, Германија). Фура-2 (0,1-1,0 мМ) беше вчитана во ќелијата преку печ-пипета во конфигурацијата на целата ќелија. Флуоресценцијата беше земена мостра со фреквенција од 1 Hz (28).

Фракционо Ca 2+ струја, Пф, се дефинира како процент од Ca 2+ струја во вкупната струја што минува низ катјонски канал (да речеме, Јас HCN4 во овој случај). Според првичната дефиниција (6), каде Јас HCN е HCN4 струја, и Јас HCN, Ca е предложениот дробен Јас HCN4 струја што ја носи Ca 2+. ΔFd е промената на Fd, што е „модифициран сигнал за фура -2 чувствителен на Ca 2+“ непосредно пред (Fd') и потоа (Fd″) Наплив на напон предизвикан од Ca 2+ прилив (3), Fd = F340 –F380, ΔFd = Fd″ – Fd′, И ѓ макс е константа, која се одредува со мерење на прилив на Ca 2+ преку калциумови канали со напон, во хромафинските клетки под услов интрацелуларната фура-2 да е доволно висока (& gt0,4 mM) (6). Во физиолошки услови, сите јони што придонесуваат за струјата низ каналите Ca 2+ се Ca 2+ (3), или Пф = 100%. Од Ек.1, ние имаме ѓ макс = ΔFd/(∫Јас Ca дт), каде Јас Ca е струја низ канали Ca 2+ со напон.

За да го снимите временскиот тек на дијализата на фура-2, следете го реф. 6, ние користевме Ca 2+ -независен сигнал за флуоресценција F360, кој може да се пресмета од F340 и F380. F360 = F340 + αF380, каде α е „изоефикасен“ и може да се определи со било какво експериментално снимање што покажува брзи промени во концентрацијата на Ca 2+. Во нашето поставување, α = 0,35. Бидејќи F360 е независен од Ca 2+, може да се користи како показател за интрацелуларната концентрација на фура-2 [фура]јасНа По воспоставувањето на конфигурацијата за снимање на целата ќелија, фура-2 беше дијализирана во ќелијата, и ова беше придружено со пропорционално зголемување на Ф360. Откако F360 достигна ниво на стабилна состојба, претпоставивме дека [фура]јас беше еднаква на концентрацијата на фура-2 во пипетата (види слика 3 и ref. 6).

Протоколи за мерење на прилив на Ca 2+ преку канали HCN4. (А) Ca 2+ сигнали како одговор на деполаризирачки импулси (Б долу десно) во ќелија на хромафин (Ca со напон) 2 + струја, VDCC, Право) и до хиперполаризирачки импулси (Б долу лево) во ќелија HEK293 која изразува HCN4 (HCN, Лево). Ca 2 + сигнали за време на вчитување на фура-2 (1 мМ во пипетата) F360 (горните траги, што укажува на влегување на фура-2 во ќелијата), F380 (средни траги, што укажува на прилив на Ca 2+) и [Ca 2+]јас (траги од дното) се прикажани. Испрекинатите линии се основни. (Б) Ca 2+ струја (Право) и Јас HCN4 (Лево) со соодветните Fd (врвни траги). Fd промени предизвикани од протоколите за напон (Дното) се прикажани како ΔFd1 и ΔFd2 за HCN4 и VDCC, соодветно. Испрекинатите линии во тековните траги укажуваат на нула. Засенчените области го означуваат вкупниот полнеж на јонскиот прилив низ каналите. (В) Одредување на фракционата Ca 2+ струја преку HCN4 канали. ΔFd1 за HCN4 и ΔFd2 за VDCC се заверени против јонскиот прилив. (Влегување) Равенката што се користи за пресметување Пф (види Материјали и методи). (ГВо споредба со VDCC (Пф = 100%) во клетките на хромафинот (3), на Пф на HCN4 е 0,60 ± 0,02% (н = 7).

Според Ек. 1, со мерење на сигналот на фура-2 предизвикан по активирање на Јас HCN4 во ќелиите HEK293 што изразуваат канали на HCN, Пф на HCN каналите може да се одреди.

Интрацелуларна бесплатна концентрација на Ca 2+, [Ca 2+]јас, беше измерено според Гринкевич и сорНа (29): [Ca 2+]јас = К еф·(РР 0)/(Р 1Р), каде Р 0 = 0.1, Р 1 = 3,4, и К еф = 1938 nM, како што е определено со стандардни калибрации (29, 30).

Податоците беа анализирани со софтвер igor pro -3.12 (WaveMetrics, Lake Oswego, OR). Освен ако не е поинаку наведено, податоците се претставени како средна вредност ± СД. Статистичкото значење беше тестирано со Студент т тест. П & lt 0,05 се сметаше за статистички значајна.


Дискусија

Скрининг со висока пропусност доведе до минијатуризација на анализите и адаптација за скрининг на голем број соединенија во напорите за откривање и развој на лекови. Меѓу функционалните техники за анализа за таков скрининг, флуоресценцијата привлече големо внимание доцна (16, 18-22). Најшироко користени флуоресцентни сонди за функционална анализа на никотински рецептори се флуо- и фура-боите за калциум хелати развиени од Циен (39-41). Бојата за калциум што се користи во оваа студија е слична по природа со боите со интензитет Флуо-3,4, освен што секундарна боја е вградена за да ја маскира флуоресценцијата во позадина поради истоварена и екструдирана боја (31). Оваа боја за маскирање ја елиминира потребата за миење на екстрацелуларната боја, со што се поедноставува анализата и се зголемува репродуктивноста.

Сегашните методи овозможуваат брз скрининг на соединенијата за евалуација на структурата-активност и специфичноста на подтиповите за никотинските рецептори. Инструментот со 96 бунари што се користи во тековната студија има интегриран модул за флуидика што ги испушта реагенсите за време на добивање сигнал. Може да се програмираат до три додатоци, што овозможува да се тестираат стекнување одговори од соединението, референтен агонист и калибрант. Овој протокол овозможува да се процени агонистичката и антагонистичката активност во рамките на истиот експеримент, бидејќи агонистот ќе произведе почетна реакција на флуоресценција, додека антагонистот нема. Сепак, и двете ќе предизвикаат инхибиција на последователна стимулација на никотин. Инхибицијата забележана за никотински агонисти може да резултира од десензибилизација или блокада на отворени канали (27-30). ЕЗ50 и ИЦ50 вредностите за агонистите беа слични по големина во клетките KXα3β4R2, KXα4β4R1 и ​​TE-671. Во ќелиите IMR-32, SH-SY5Y и K-177, IC50 вредностите за инхибиција на никотинскиот одговор од страна на цитизин беа значително повисоки од ЕК50 вредности за активирање на цитизин. Интересно, клетките на KXα4β2R2 бараа пониски концентрации за инхибиција на никотинскиот одговор отколку за активирање од сите четири агонисти (Табела 3). Потребни се дополнителни кинетички студии за да се откријат причините за таквите резултати, бидејќи одговорите на агонистите честопати не беа целосно распаднати пред последователното додавање на референтниот агонист, никотин. Додека фармаколошкото толкување на кривите на инхибиција за агонистите не е јасно, тие може да послужат како дијагностичка алатка за никотинска активност. Во случај на антагонисти, параметрите на инхибиција ќе зависат од механизмот и временскиот тек на блокадата.

Тековната парадигма обезбедува кинетички податоци и овозможува проценка на агонизмот и антагонизмот во рамките на истиот експеримент. Употребата на бои за кои не е потребно перење ја намалува варијабилноста поради одвојување на клетките. Конечно, употребата на автоматски читач на плочи/течни ракувачи ја зголемува репродуктивноста на додатоците. Мембранската потенцијална анализа изгледа многу почувствителна од анализата на флуоресценција на калциум, но дава податоци согласни или со флуоресценција на калциум или со анализи на ефлукс од 86 Rb (Табела 2 и Слика 4).

Иако мерењето на флуоресценција на активноста на никотинските рецептори преку динамика на калциум е документирано опсежно во последниве години (16, 18-20, 31), употребата на мембранскиот потенцијал за никотински рецептори е нова и доста чувствителна. Употребата на мембранскиот потенцијал е особено важна за клеточните линии кои минуваат малку или без калциум. ТЕ-671 клетките, кои го изразуваат невромускулниот подтип на никотински рецептор (8), имаат ниска спроводливост и експресија на калциум. Навистина, не бевме во можност да добиеме значителен одговор на калциум с well до минатото спојување на клетките, а потоа само слабо. Слаби сигнали за калциум беа исто така забележани со К-177 клетки што изразуваат човечки α4β2 рецептори, и со SH-SY5Y и IMR-32 клетки, изразувајќи ги човечките ганглионски рецептори подтипови. Не можеше да се забележат сигнали за калциум со KXα4β2R2 и KXα4β4R1 (податоците не се прикажани). Мембранскиот потенцијал, сепак, дава прифатливи сигнали во сите клеточни линии што се користат овде и многу силни сигнали во неколку.

Мембранската потенцијална флуоресценција, иако обезбедува дополнителни податоци за флуоресценција на калциум и ефлукс од 86 Rb, не обезбеди идентични податоци. Агонистите беа конзистентно и значително посилни во анализата на потенцијалот на мембраната, додека антагонистите беа помалку потентни. Покрај тоа, потенцијата на мекамиламин во клетките KXα3β4R2 беше ≈20- до 40 пати помала отколку во клетките IMR-32 или SH-SY5Y, иако се смета дека овие клеточни линии изразуваат слични никотински рецептори од ганглионски тип. Функционалните одговори во IMR-32 клетките се припишуваат главно на α3β4 рецептори врз основа на електрофизиолошки мерења (35). IMR-32 и SH-SY5Y клетките го изразуваат рецепторот на & lt100 fmol/mg протеин (23, 37), додека KXα3β4R2 клетките ги изразуваат рецепторите на ≈8.000 fmol/mg протеин (25). Можно е разликите во потенцијата да се должат на разликите во барањата за активирање на фракциони рецептори за деполаризација на мембраната. Овој механизам исто така може да ги објасни разликите во потенцијата помеѓу анализите на потенцијалот на калциум и мембрана за антагонисти. Во случај на агонисти, можно е само мал дел од рецепторите да се активираат за да се деполаризира мембраната (фракцијата зависи од бројот на рецепторите), што резултира со зголемена очигледна моќ. Спротивно на тоа, антагонистите би требало да инхибираат многу поголем дел од рецепторите за да спречат деполаризација, што резултира со намалена очигледна потенција. Ова е потенцијално важно набудување, бидејќи таквите деполаризации дејствуваат како предизвикувачки настан за отворање на јонски канали со напон и други процеси зависни од потенцијалната мембрана.


Распространети HTS методи за специфичните семејства на јонски канали

Пред да изберете идеален метод (и) за скрининг, важно е да одредите што да барате кога ги споредувате технологиите и нивните апликации. Осум параметри кои најчесто се разгледуваат вклучуваат чувствителност, специфичност, проток, временска резолуција, робусност, флексибилност, цена и физиолошка важност. Меѓу сите формати на анализа на јонски канали, несомнено, автоматската анализа на стегач за закрпи е најдобриот избор што обезбедува добар квалитет на податоците и овозможува поголем проток. Во моментов, автоматската анализа на електрофизиологија останува скапа. Така, не секоја лабораторија може да си го дозволи тоа. Затоа, како компромис, комбинацијата на технологии за скрининг базирани на флуоресценција и автоматска стегач за печ стана најчесто користениот метод за откривање на лекови насочени кон јонски канали. Со намалување на трошоците и подобрување на технологијата, автоматизираната електрофизиологија ќе стане доминантен формат на анализа за повеќето подтипови на јонски канали. За различни подкласи на јонски канали, методите на скрининг со голема пропусност се разликуваат поради селективноста на јони, кинетика за активирање на канали и разгледување дали е потребен лиганд. За избрана цел на јонски канали, дијаграмот на проток на скрининг со голема моќност е сумиран на Слика 1. Поделен е во 3 фази: анализа базирана на флуоресценција за примарен скрининг, автоматизирана валидација на стегач за секундарен скрининг и рачно карактеризирање на закрпи за терцијарен скрининг. Бидејќи постојат многу фамилии и подкласи на јонски канали, најчесто користените методи на скрининг ќе се дискутираат врз основа на јонска селективност или пропустливост. Дијаграмите за репрезентативните методи на скрининг се прикажани на слика 2.

Гасовод со високопропусен скрининг насочувајќи јонски канали. (А) За голема библиотека со соединенија, соединенијата прво се прикажуваат со помош на анализа на флукс базирана на флуоресценција на стабилна клеточна линија изразена од јонски канали, а идентификуваните удари се потврдуваат на истите клетки и се контра-прикажани на родителските клетки да се исклучат неспецифични хитови. (Б) Второ, активните удари се тестираат со помош на автоматизирана стега за закрпи за валидација и, активните удари се фармаколошки оценети за односот структура-активност (САР) додека не се идентификуваат соединенијата на олово. (В) Конечно, рачна клешта за закрпи се користи за да се карактеризираат биофизичките својства на стабилните клеточни линии и мајчините клетки.

Дијаграм на методи за скрининг со голема пропусност. (А) Дијаграм на анализа на талиум-флукс за канали на калиум, затворена состојба, отворена состојба и сиров сигнал. За калиумски канал, анализата на Tl + -флукс е најчесто користениот формат на анализа. За да се активира каналот, обично се користи раствор со висок К + за да се деполаризира потенцијалот на мембраната. Потоа, талиумот поминува во клетките преку отворени канали за калиум. Кога цитозолниот талиум се врзува за бојата, сигналот за флуоресценција е кинетички зголемен. Суровите траги се добиени од примарниот скрининг на калиумските канали KCNQ2. Црните, црвените и сините сурови траги претставуваат ефект на тампон контрола, активатор и инхибитор, соодветно.(Б) Дијаграм на анализа на флукс на калциум за канали зафатени со калциум. Флуо-4 е најчесто користениот индикатор за калциум за канали вклучени во калциум. За да се активира поврзаниот канал, се користи високо-Ca 2+ или агонист на каналот за да се отвори каналот или да се зголеми цитосолот Ca 2+. Суровите податоци се добиени од примарниот скрининг на каналот TRPC4. За скрининг на повеќе класи модулатори, беа применети три додавања за истиот бунар. Првиот додаток е за прикажаните соединенија без ДАМГО (високо селективен пептиден агонист за μ опиоидниот рецептор) за скрининг на агонист. Второто дополнување е ЕК20 концентрација на DAMGO за алостерични модулатори. Третото дополнување е ЕК80 концентрација на DAMGO за антагонисти. Црните траги претставуваат соединенија без никаков ефект на трите додавања. Црвените траги претставуваат соединенија со агонистички ефект. Сините траги претставуваат соединенија со антагонистички ефект. (В) Дијаграм на канали селективни за хлорид. Мутираниот YFP (H148Q и I152L) беше ко-изразен со канали за селектирање на хлорид. Кога каналот се отвора, јодидот влегува во клетките преку канали на хлорид, се врзува за YFP и ја гаси неговата флуоресценција. Суровите податоци се добиени од примарниот скрининг на калциум-активиран канал на хлорид (TMEM16A). Иномицин се користеше како агонист за активирање на каналот. Црвената трага ги претставува каналите активирани со јономицин. Сината трага го претставува ефектот на инхибитор.

Канали за селектирање на калиум

Каналите кои селектираат калиум се најголемата и најразновидната група меѓу семејствата на јонските канали. Класите на канали вклучуваат напонски затворени (Кс), навнатре-исправувачки (КIR), двопорна (К2P) и активирано со Ca 2+ (КCa) калиумови канали. Повеќе формати на анализи се применети на ова големо семејство, вклучувајќи го и тестот за врзување на лиганд, 86 Rb + анализа на флукс, анализа на боја осетлива на напон и анализа на флукс на Tl +. Меѓу нив, анализата на флуксот Tl + најчесто се користи за идентификување на модулатори на калиумски канали 24. Во оваа анализа, Tl + се користи како сурогат јон за K +, а неговиот прилив во клетките првично се мери со употреба на флуоресцентна боја осетлива на талиум, бензотиазол (БТК) 24,50, што е Ca 2+ индикатор со низок Ca 2+ -врзувачки афинитет (Кг= 7 μmol/L). Користејќи комерцијално достапен комплет за анализа на талиум (FluxOR ™, Life Technologies), методот е успешно развиен за голем број калиумски канали. Анализата на флуксот Tl + е широко користена во скринингот на калиумовите канали, како што е Кс 24,51,52,53,54,55,56, КIR 57,58,59, К2P 60,61,62 и КCa 63,64 канали. Треба да се напомене дека различни патеки надвор од целта (на пр, Na + /K + ATPase) од мајчин HEK-293 или CHO-K1 (овие два типа на родителски клетки најчесто се користат) клетките би можеле да го попречат приливот на Tl +, што ќе предизвика повисока лажно-позитивна или лажно-негативна хит стапка. Затоа, неопходен е контра -скрининг против родителските клетки за да се елиминираат лажните удари што комуницираат со родителските клетки. Покрај тоа, анализата треба да се постапува со голема претпазливост поради токсичноста на талиумот.

Ca 2+ вклучени јонски канали

Интрацелуларниот јон на калциум (Ca 2+) е универзален втор гласник кој ги контролира и физиолошките и патолошките процеси. Меѓу споменатите јонски индикатори, индикаторите за калциум најчесто се користат 65 бидејќи ја менуваат нивната емисија на флуоресценција при врзување на калциумот. Во моментов, достапни се над сто индикатори за хемиски синтетизирани и генетски кодирани 66. Хемиските показатели кои најчесто се користат вклучуваат Фура-2, Индо-1, Флуо-3 и Флуо-4, кои се деривати на селективен хелатор Ca 2+ БАПТА 30,67.

Во зависност од апликацијата, боите на калциум се достапни во различни афинитети со јони на калциум 68, спектар на возбуда и емисија и хемиски форми (пропустливи за мембрана или не). Тие покажуваат различна временска резолуција (од милисекунди, како што се Флуо-3 и Флуо-4, до десетици секунди, како што е Фура-2) и различни степени на точност за секој опсег на концентрации на калциум. На пример, Индо-1 е подобар од Флуо-3 за мерење на големи и релативно бавни интрацелуларни транзиенти на калциум кои се поврзани со клеточна контракција. Спротивно на тоа, Fluo-3 е најпосакуван за мерење мали, брзи преодни врски поврзани со „искри“ на калциум 69. Затоа, Fluo-3 (вклучувајќи го и неговиот дериват Fluo-4) е посоодветен за откривање на сигнали на јонски канали вклучени во Ca2+. За скрининг со висока пропусност на јонски канали вклучени Ca 2+, достапни се комерцијални комплети, како што се комплетите за анализа на калциум Fluo-4 (Life Technologies). Тие се широко применети во анализи на јонски канали вклучени Ca2+, како што се калциумови канали со напон 33,70, TRP канали 71,72,73,74,75 и NMDA рецептори 76,77.

Понатаму, калциумовите канали постојат меѓу затворени, отворени и инактивирани состојби. За да се разликуваат инхибиторите зависни од состојбата, обично генот на внатрешниот исправувач на калиумски канал (на пр, Кир2.3) е ко-изразен со калциумови канали. Така, потенцијалот на мембраната може да се прилагоди со менување на надворешните концентрации на К +. Овој пристап успешно се користи за да се идентификуваат инхибитори зависни од состојбата и да се карактеризира молекуларната селективност, дури и да се понудат некои предности во однос на електрофизиологијата 33,41. Стратегијата може да се примени и на натриумовите канали. Анализите на јонски канали базирани на боја на калциум страдаат од мешање од други клеточни процеси кои предизвикуваат промени во интрацелуларната концентрација на калциум. Контра скринингот за истата анализа треба да се спроведе против родителските клетки за да се отстранат неспецифичните соединенија.

Натриумски канали со напон

Натриумските канали со напон се важни цели за лекување на возбудливи болести, како што се епилепсија и невропатска болка. Познато е дека натриумските канали со напон се затворени во затворени, отворени и инактивирани состојби. Дополнително, за натриумовите канали изразени во клетките ХЕК-293, мембранскиот потенцијал е на подеполаризирано ниво. Земајќи го подтипот на натриумовиот канал Nav1.7 изразен во HEK-293 клетки како пример, просечниот мембрански потенцијал е измерен да биде приближно −24 mV, просечна вредност од панел од приближно 50 клетки (податоците не се објавени). Така, ова ќе ги доведе повеќето канали во инактивирани состојби, наместо нивните вистински „состојби во мирување“. Затоа, познат инхибитор на инактивација на Nav, вератридин 78, најчесто се користи за отворање на каналите, што произведува посилен сигнал.

Идеално, јонските селективни индикатори се совршени за анализа на специфичните јонски канали. Сепак, достапните осетливи бои за Na + (на пр, SBFI 26, бои CoroNa 79 и Asante Natrium Green-2 80) не се добро прилагодени за скрининг со голема пропустливост поради ниската чувствителност и слабиот сооднос сигнал-позадина. Анализа на потенцијална боја на мембрана базирана на флуоресценција (на пр, DiBAC и FRET бои) често се користи за скрининг на натриумски канали. За самата анализа, промената на сигналот првенствено е под влијание на мембранскиот потенцијал. Затоа, секој настан што го менува потенцијалот на мембраната ги модулира сигналите. Така, методот базиран на боја може да даде релативно висока лажно-позитивна и/или лажно-негативна стапка во споредба со електрофизиолошките методи. Неодамна, методот заснован на флукс на талиум (Tl + флукс) 81, вредна техника за калиумови канали, успешно е развиен како функционална анализа за натриумските канали Nav1.7. Методите на флукс на Tl + создаваат драматично поголеми сигнали, кои се супериорни во однос на најсовремените осетливи на Na + бои и се подложни на HTS на натриумовите канали. Примена на лиганди (на пр, вератридин) може да комуницира со испитуваните соединенија и со тоа да ги зголеми стапките на лажно-позитивни или лажно-негативни. Покрај тоа, новоразвиена анализа на флукс на калциум (анализа SoCal) 82 се користи како отчитување на функционалната промена на Nav каналите. Во оваа анализа, каналите Nav беа генетски дизајнирани за да произведат постојани Nav струи со нарушена брза инактивација и зголемена пропустливост на калциум. Така, известувачите за калциум, вклучувајќи ги и хемиските бои и генетски кодираните сензори, ќе бидат алтернативни показатели за каналите Nav. Иако анализата SoCal покажува добра проценка на активноста за огромното мнозинство тестирани соединенија, сепак се препорачува хитовите дополнително да се потврдат со помош на електрофизиолошка метода во канали за диви видови Nav. Поради ограниченоста во контролирањето на состојбата на натриумовите канали во споредба со електрофизиологијата, треба да се внимава при толкување на податоците за инхибиторите од пристапот базиран на флуоресценција.

Канали селективни за хлорид

За канали со хлорид, развиена е анализата за гаснење на жолт флуоресцентен протеин (YFP) 27. Првично, YFP-H148Q имаше поголема селективност за јодид (I-) отколку хлорид (Cl-) поради својствата за врзување на халид на YFP 27. Сепак, H148Q бара значителни концентрации на јодид за да се произведе прифатлив сигнал, што ќе манифестира клеточна токсичност. Пристапот на случајна мутација, YFP-I152L, има значително зголемена чувствителност на јодид 27,29. Така, YFP (H148Q и I152L) во комбинација со јодид беше широко користен за скрининг на хлоридниот канал. При активирање на хлоридниот канал, I152L влегува во клетките, се врзува за YFP и ја гаси неговата флуоресценција. Потоа, гасењето зависно од агонисти на флуоресценција на YFP може да се измери со читач на флуоресценција и да се користи за одредување на активирање, инхибиција и модулација на каналот. YFP анализата е неинвазивна техника која ги мери брзите реакции. Анализата е широко развиена за селективни канали и рецептори за хлорид, вклучувајќи CFTR 83,84, калциум-активирани Cl-канали (CaCC) (TMEM16A) 85,86,87,88, рецептори за глицин 89 и GABA рецептори 89,90. Дополнително, методот на обојување чувствителен на напон може да се користи за испитување на каналите на хлорид, но ретко се користи за оваа класа канали.

Бидејќи потенцијалот на мембраната не може да се контролира како електрофизиолошки анализи во гореспоменатите анализи базирани на флуоресценција, образложението е да се подобри односот сигнал-бучава за време на развојот на анализата на HTS. Општо земено, постојат два пристапи за подобрување на односот сигнал-шум: зголемување на сигналот или намалување на бучавата. Сигналот може да се зголеми со создавање услови под кои се отвораат повеќе канали. Ова може да се постигне со примена на висок К + за да се предизвика деполаризација на мембраната или со примена на лиганди за возење на каналите во поактивирани состојби. Бучавата може ефикасно да се намали со помош на нефизиолошки сурогат јони, како што е талиум за К + и јодид за Cl-. Овие сурогат јони се речиси непостоечки во клетките и затоа нивното ниво на бучава е многу ниско. Дури и мала количина интрацелуларна промена на овие сурогатни јони може лесно да се открие.


Соматски сигнали за калциум: за неврони со високи стапки на отпуштање

Некои неврони, како што се ГАБАергичните клетки со брзо шилење во неокортексот, имаат високи стапки на отпуштање. Иако заклучокот станува с difficult потежок, снимањето на калциум с still уште може да биде атрактивен пристап, бидејќи некои подтипови на интерневрони се малку во бројки и ретко се распоредени и, според тоа, тешко се снимаат со други методи. Апликациите на интерневронски слики вклучуваат определување на селективност на ориентација на подтипови на GABAergic неврони во визуелниот кортекс на глодари 40 и расчленување на функционалните одговори на подтиповите на интерневроните за време на задачите со одложен одговор. 41

Пред неколку години, ние извршивме истовремено снимање и електрофизиолошко снимање за да обезбедиме доказ за директна врска помеѓу соматските сигнали на калциум и стапките на отпуштање кај кортикалните ГАБАергични неврони 32 (Слика 2). Одредени интерневрони, како што се клетките кои брзо изразуваат парвалбумин (ПВ), имаат висок in vivo стапка на отпуштање - до моментална стапка од ∼ 35 Hz кај анестезирани глувци во нашата студија и просечна стапка од ∼ 50 Hz кај будни глувци кои се однесуваат. 42, 43 Од неколку причини, како што е наведено на крајот од овој дел, заклучувањето на времето на индивидуалните акциони потенцијали беше непрецизно во нашата оригинална студија. Како и да е, повеќето ФВ ќелии прикажаа сигнали за флуоресценција кои внимателно ја следеа стапката на отпуштање [Сл. 2 (а)]. Затоа, дури и во случај кога индивидуалните скокови не можеа да се решат, снимањето на калциум може да се користи за да се прочитаат промените во стапката на отпуштање.


2. Флуоресцентни анализи со користење на мембрански потенцијални осетливи бои

2.1 Преглед на анализа

Јонските канали претставуваат класа протеини со потенцијал за терапевтска интервенција. Хуманите генетски студии идентификуваа цели на јонски канали кои се релевантни за лекување на специфични болести со јасно исполнети клинички потреби. Покрај тоа, постои фармаколошка валидација за други цели на јонски канали поврзани со медицински состојби кои не се добро третирани со тековните лекови. Предизвикот за полето на јонски канали е да се идентификуваат потентни и селективни модулатори на јонски канали со соодветни карактеристики што ќе овозможат нивна евалуација во клиничките испитувања. Значително подобрување на технологијата во последните неколку години со автоматизирани електрофизиолошки инструменти обезбеди дополнителни платформи кои можат да го поддржат развојот на лекови за јонски канали. Сепак, ниту еден од овие инструменти с can уште не може да поддржи скрининг на големи хемиски библиотеки (т.е. > 1 М соединенија) кои обично се потребни за да се идентификуваат нови водечки кандидати за цели на јонски канали на кои им недостасуваат остварливи сонди или води. Покрај тоа, високата цена на автоматизираните потрошни материјали за електрофизиологија бара потрага по алтернативни технологии за мерење на активностите на јонските канали во формати со висока густина. Иако овие технологии не можат да ја заменат електрофизиолошката евалуација на понапредните кандидати за лекови, тие можат да играат важна улога во идентификацијата и оптимизацијата на олово.

Бидејќи јонските канали продираат во јони со голема брзина кога се отвораат, затоа активноста на овие протеини може да предизвика промени во напонот на мембраната. Кога се правилно подесени, активноста на јонските канали изразена во клетките на цицачите може индиректно да се следи со употреба на мембрански потенцијални обојувачки бои кои обезбедуваат сигнал за флуоресценција. Овие анализи можат да работат во формати на плочи со 96-, 384- или 1536 бунари со пониска цена и поголем проток од моментално достапните автоматски електрофизиолошки платформи. Меѓутоа, за да бидат корисни анализи базирани на потенцијал на мембрана, мора да се применат ригорозни критериуми за валидација за да се осигура дека сигналот за флуоресценција обезбедува сигурно мерење на активноста на каналот. Пренос на енергија со флуоресцентна резонанца (FRET) со употреба на пар бои, кумарин закотвен со фосфолипиди и хидрофобен оксанол кој брзо се дистрибуира во мембраната според трансмембранското поле, може да обезбеди силни и репродуктивни сигнали при проучување на напонската активност. затворен натриум, калиум и други канали. Навистина, анализата може да се намести за да се идентификуваат или активатори или инхибитори на даден јонски канал. Општиот концепт при дизајнирање анализи за инхибитори на калиумови канали е илустриран подолу на Слика 1.

Слика 1:

Флуоресцентна база на мембрански формат за потенцијален анализа за откривање на инхибитори на калиумски канали. Флуоресцентни бои се користат за мерење на деполаризација на клетките по додавање на висока концентрација на калиум во екстрацелуларниот раствор. Голема деполаризација (повеќе.)

Конструирани се клеточни линии што го изразуваат калиумскиот канал од интерес. Во овие ќелии, стабилно изразениот канал го поставува потенцијалот за одмор

-90 mV Под контролни услови, додавање на раствор со висок калиум ќе предизвика деполаризација на клетките, а оваа промена на напонот може да се измери со фрејтите ФРЕТ. Во илустрираниот пример, сино-црвените флуоресцентни сигнали претставуваат емисија на N- (6-Хлоро-7-хидроксикумарин-3-карбонил) -димиристоилфосфатидилетаноламин (CC2 𠄝MPE) и бис- (1,3-дитилтиобарбиторен киселина) триметит (DiSBAC2 (3)), соодветно, додека зелениот сигнал го претставува односот на CC2 𠄝MPE на DiSBAC2(3). Може да се види дека по додавање на висок раствор на калиум (горните панели на слика 1), интензитетот на емисијата на DiSBAC2(3) се намалува поради движењето на бојата кон внатрешниот лист на мембраната. Како последица на тоа, се зголемува емисијата на CC2 𠄝MPE и се воспоставува нов сооднос на флуоресценција. Кога клетките се претходно инкубирани со инхибитор на калиумски канали (долните панели на слика 1), ќе се појави деполаризација на клетките и понатамошното додавање на раствор со висок калиум нема да влијае на FRET сигналот. Така, може да се воспостави голем сигнал за анализа за идентификување на инхибитори на канали. Овој дизајн на анализа работи добро и со калиумски канали со напон и со напон.

За идентификување на активатори на калиумски канали, следниот концепт на анализа може да се користи како што е прикажано на Слика 2.

Слика 2:

Флуоресцентна база на мембрански формат за потенцијален анализа за откривање активатори на калиумски канали. Флуоресцентни бои се користат за мерење на деполаризација на клетките по додавање на висока концентрација на калиум во екстрацелуларниот раствор. Калиумот предизвикува (повеќе.)

Конструирани се мобилни линии што го изразуваат каналот на интерес. Во овие клетки, изразениот калиум канал не е способен да го постави потенцијалот за одмор поради комбинација на ниски нивоа на изразување и/или ниска веројатност за отворање, а потенцијалот на клеточната мембрана е воспоставен во близина на нула mV. Меѓутоа, во присуство на активатор на канал (агонист) кој ја зголемува веројатноста за отворање на каналот, потенцијалот на клеточната мембрана ќе стане хиперполаризиран со поместување кон потенцијалот за рамнотежа на калиум. По додавање на раствор со висок калиум, контролните ќелии нема да прикажат промена во сигналот FRET, додека голема промена во FRET ќе се забележи во оние бунари во кои е присутен активатор на канали. Во илустрираниот пример, сино -црвените флуоресцентни сигнали претставуваат емисија на CC2 𠄝MPE и DiSBAC2(3), соодветно, додека зелениот сигнал го претставува односот на CC2 𠄝MPE на DiSBAC2(3).

Анализата што се користи за идентификација на инхибитори на натриумските канали со напон (Nav) може да се спроведе со помош на следнава шема прикажана на слика 3.

Слика 3:

Флуоресцентна база на мембрански формат за потенцијален анализа за откривање на инхибитори на натриумски канали со напон. Се користи агонист на натриумски канали (вератридин) за отстранување на инактивација на каналот што доведува до наплив на натриум и клеточна деполаризација измерена со флуоресцентна (повеќе.)

Кај клетките на цицачите, стабилно изразените Nav канали престојуваат главно во не-проводна инактивирана состојба поради деполаризираниот потенцијал на мембраната за одмор на клетките (-20 до -50 mV), бидејќи натриумовите канали брзо се отвораат, потоа се инактивираат и остануваат затворени како одговор на мембрана деполаризација НаСепак, се смета дека оваа конформација на каналот претставува висока афинитетна состојба за интеракција со некои класи инхибитори, а исто така се смета дека е поизразена во некои состојби на болести. Изложеноста на клетките на Nav агонист, како што е вератридин, ја отстранува инактивацијата и овозможува влез на натриумови јони во клетките преку отворени, неблокирани канали, предизвикувајќи деполаризација на клетките кон потенцијалот за рамнотежа на натриум, со последователна промена на сигналот FRET. Во илустрираниот пример, сино -црвените флуоресцентни сигнали претставуваат емисија на CC2 𠄝MPE и DiSBAC2(3), соодветно, додека зелениот сигнал го претставува односот на CC2 𠄝MPE на DiSBAC2(3), и индивидуални бунарски одговори на зголемена концентрација на вератридин се прикажани. Во присуство на Nav инхибитор, FRET сигналот ќе биде непроменет по додавањето на Nav агонистот, бидејќи рамнотежата на каналот би била поместена кон инактивирана состојба поврзана со лекови, која може да не се отвори додека инхибиторот не се дисоцира. Важно е да се одреди оптимална концентрација на вератридин што дава силен сигнал, додека не влијае значително на чувствителноста на инхибиторите. Овој формат на анализа работи добро за неколку Nav1.X канали, иако вистинскиот агонист што се користи за да започне натриум прилив варира во зависност од каналот што се испитува.

2.2. Општи размислувања

Анализите опишани погоре можат да обезбедат силни, репродуктивни сигнали и да работат со високи Z ’ фактори во плочи со 96, 384 и 1536 бунари. Особено внимание на условите за клеточна култура е критично за успехот на анализата. Cелиите треба да бидат слични, но не и обраснати, за анализата да работи правилно. Операторот треба да ги идентификува условите за раст на клетките и густината на обложување на клетки кои се соодветни за да се обезбеди добар сигнал за анализа. Ракувањето со боите е исто така важно бидејќи овие молекули се липофилни по природа и понекогаш е тешко да се стават во раствор. Забележано е врзување на овие реагенси за пластични површини и затоа е подобро да се користат стаклени површини за подготовка на бои и решенија#x02019.

2.3. Мобилни линии

Анализите опишани погоре можат да обезбедат силни, репродуктивни сигнали и да работат со високи Z ’ фактори во плочи со 96, 384 и 1536 бунари. Особено внимание на условите за клеточна култура е критично за успехот на анализата. Cелиите треба да бидат слични, но не и обраснати, за анализата да работи правилно. Операторот треба да ги идентификува условите за раст на клетката и густината на обложување на клетки кои се соодветни за да се обезбеди добар сигнал за анализа. Ракувањето со боите е исто така важно бидејќи овие молекули се липофилни по природа и понекогаш е тешко да се стават во раствор. Забележано е врзување на овие реагенси за пластични површини и затоа е подобро да се користат стаклени површини за подготовка на бои и решенија#x02019.

2.4. Параметри на анализа

За време на оптимизацијата на анализата, клучен почетен експеримент е да се оцени матрицата на концентрации на боја за да се идентификуваат оние што се оптимални за одредената клеточна линија и анализа што се разгледува. Покрај репродуктивноста и високите Z ’ фактори, секоја анализа треба дополнително да се потврди со употреба на фармаколошки модулатори за канали. Различни структурни класи и механизми на дејствување треба да прикажуваат ефекти што одговараат на својствата забележани во електрофизиолошките или други добро дефинирани биохемиски експерименти. Ако не, промените во параметрите на анализата треба да се истражат за да се постигнат најоптималните услови. На пример, за каналите Nav, концентрацијата на агонисти е од клучно значење за да се обезбеди фармаколошко отчитување кое добро корелира со електрофизиолошките вредности. Кога концентрацијата на агонисти е превисока, поместување на кривите концентрација-одговор на инхибиторите кон повисока IC50 ќе се појават вредности, па дури и може значително да влијае на одговорот на одредени структурни класи на инхибитори на таков начин што анализата ќе стане нечувствителна на присуството на овие агенси. Кривата на концентрација-одговор на агонист, како на пример погоре илустрираниот пример со вератридин, треба да се изведува секојдневно за да се идентификува состојбата што обезбедува силен, но не заситен сигнал. Бидејќи кривините на концентрација-одговор на агонист се доста стрмни, не е можно да се погоди оптималната концентрација на агонист за дадена анализа, бидејќи други фактори, како што е специфичната состојба на клетките, можат да влијаат на одговорот. Општо земено, времето на пред-инкубација од 30 минути со тест соединение се чини дека е оптимално. Подолгото време на инкубација од 45 минути може да започне да ја загрозува верноста на анализата најверојатно поради проблеми поврзани со токсичност од употребата на бои.

Сите плочи за анализа секогаш треба да содржат соодветни контроли. Плочите што не се во согласност со минималниот фактор Z ’ треба да се отфрлат. За време на оптимизацијата на олово, мора да се вклучат кривите на концентрација-одговор на стандардните модулатори на канали за да се осигура дека фармаколошките одговори на новите соединенија се значајни. Особено внимание мора да се посвети на бунарите поставени на рабовите на плочата. Ако има какви било проблеми со сигналите за анализа од овие работни бунари, тогаш проблемот треба да се поправи или инаку овие бунари не треба да се земат предвид при пресметување на податоците. Употребата на неколку копии по точка на податоци обезбедува поголема точност кога се користи равенка на Хил со четири параметри за да се пресмета IC50 или ЕЗ50 вредности.

2.5. Анализа на податоци

Во анализите за калиумски канали, одговорите на сигналот FRET на додавање на раствор со висок калиум се одраз на мембранскиот потенцијал на клетките пред ова додавање. Така, во овие анализи, сигналот за сооднос на флуоресценција на платото се користи за пресметување на ИЦ50 или ЕЗ50 вредности за инхибитори на канали или активатори. Во принцип, сигналот за сооднос на флуоресценција на платото останува стабилен значителен временски период, така што нема проблеми при користење на овој пристап. Кога се анализираат Nav каналите, ситуацијата е поинаква. Во овој случај, промената на потенцијалот на мембраната се активира со додавање на одреден Nav активатор. Идеално, некој би сакал да ја измери почетната стапка на промена на сигналот што треба да биде поврзана со бројот на функционални Nav канали. Меѓутоа, наклонот на сигналот FRET може да не е строго поврзан со бројот на модифицирани функционални канали и може да биде ограничен со временскиот одговор на боите и/или инструментот. Поради оваа причина, временски интервал од 3 секунди е идентификуван во контролните бунари каде што сигналот започнува да се приближува (

95%) ниво на плато. Овој ист временски интервал потоа се користи за да се одреди ефектот на тест соединенијата.

Сите најчесто користени критериуми за пресметување статистички значајни параметри од кривите на концентрација-одговор на соединенијата треба да се применат за пресметка на податоците.


Промени во интрацелуларните концентрации на калциум јон во клетките на церебеларните гранули на мутантниот глушец CACNA1A, Leaner, за време на постнаталниот развој

Одржувањето на хомеостазата на калциум јон (Ca 2+) е клучно за нормална функција на невроните. Променетата хомеостаза на Ca 2+ ги попречува сигналните процеси на Ca 2+ и влијае на преживувањето на невроните. Во оваа студија, ние користевме хомозиготни послаби и потресни мутантни глувци, кои носат автозомно -рецесивни мутации во генот што кодира за α формирање пори подединица на CaВ2.1 (P/Q-тип) напонски затворени калциумови канали (VGCC). Глувците послаби покажуваат тешка атаксија и епилепсија, додека глупавите глувци се помалку сериозно погодени. Пократките клетки на малиот гранули (CGC) покажуваат екстензивна апоптотична клеточна смрт која достигнува врв во постнаталниот (Р) ден 20 и продолжува до зрелоста. Интрацелуларен Ca 2+ ([Ca 2+]јас) се опишани концентрации во витки и растреперени клетки на Пуркиниевите глувци, но [Ca2+]јас концентрации не се пријавени за грануларни клетки, најголемата невронска популација на малиот мозок. Користејќи ја ратиометриската боја, Fura-2 AM, ја истражувавме улогата на хомеостазата на Ca 2+ во смртта на CGC за време на постнаталниот развој, демонстрирајќи базална [Ca 2+]јас, деполаризација предизвикана од Ca2+ минливи, и Ca2+ преодни по целосно блокирање на CaВ2.1 VGCC. Од P20 па наваму, базално [Ca 2+]јас нивоата во послабиот CGC беа значително пониски во споредба со CGC од див тип според возраста. Исто така, ги споредивме базалните [Ca 2+]јас нивоа на послаб и див тип CGC до базален [Ca 2+]јас во растурање на CGC. Деполаризацијата предизвикана од калиум хлорид не откри значајна разлика во минливите Ca 2+ помеѓу послабиот и дивиот тип CGC, што укажува на тоа дека иако послабите CGC имаат дисфункционален P/Q-тип VGCC, минливите Ca2+ по деполаризација се исти. Ова сугерира дека другите VGCC ги компензираат дисфункционалните P/Q канали. Ова откритие дополнително беше потврдено со целосно блокирање на CaВ2.1 VGCC користејќи ω-Агатоксин IV-A.

Калциумот (Ca 2+) е сеприсутен гласник за интрацелуларна сигнализација кој е вклучен во сите настани што се случуваат во клетките на нервниот систем. Одржување на интрацелуларен калциум ([Ca 2+]јас) хомеостазата е клучна за нормалната невронска функција, бидејќи промените значително влијаат на опстанокот на невроните. Ние ги проучуваме послабите мутантни глувци, кои носат автозомно -рецесивна мутација во генот CACNA1A, кодирајќи за α1А формирање на под -единица на CaВ2.1 (P/Q-тип) напонски затворени калциумови канали (VGCC). Хомозиготните послаби глувци покажуваат церебеларна атаксија и отсутна епилепсија, почнувајќи веднаш по постнаталниот (Р) 10-12 ден. Постои прекумерна загуба на послаби церебеларни гранулирани клетки (CGC) почнувајќи од P15, што достигнува врв на P20 и продолжува до зрелоста (Lau et al. 2004 Bawa и Abbott 2008). Неколку автозомно доминантни човечки невролошки нарушувања се поврзани со мутации во генот CACNA1A, вклучувајќи семејна хемиплегична мигрена, генерализирана епилепсија со атаксија, епизодна атаксија тип 2 и спиноцеребеларна атаксија тип-6.

Иако е направена значителна работа за да се разјасни [Ca2+]јас концентрации во Пуркиниевите клетки на овие мутирани глувци (Dove et al. 1998), никој не пријавил [Ca2+]јас концентрации во грануларни клетки, кои се најголемата невронска популација на малиот мозок и врвната смрт на грануларната клетка се совпаѓа со почетокот на атаксичниот фенотип. Измеривме базално [Ca 2+]јас како индекс на хомеостаза на калциум во CGC за време на постнаталниот развој и ги спореди резултатите со CGC од друг мутантен глушец, растреперен. Глувците со расипување носат и автозомно-рецесивна мутација во генот CACNA1A, но таа не е на иста локација со послабата мутација, и овие глувци не покажуваат невро-дегенерација како малолетници или млади возрасни лица (Флечер и сор. 1996).

Според Дове и сор. (1998), има 60% намалување на Ca 2+ струите во послабите клетки на Пуркиние, а исто така има и трикратно намалена веројатност за отворање на каналот. Калциумовите канали од типот П придонесуваат приближно 90% од целата клетка Пуркиниева ќелија Ca 2+ струја (Dove et al. 1998), додека во грануларните клетки P/Q-тип претставува 46% од целата клетка Ca 2+ струја (Рандал и Циен 1995 ). Во вториот дел од експериментот, ние го разгледавме минливото Ca 2+ со деполаризација на грануларните клетки со употреба на калиум хлорид и блокирање на струите од типот P/Q со помош на ω-Агатоксин IV-A.

Див тип (+/+), хомозиготна послаба (tg la /tg la ) и хомозиготно треперење (tg/tg) беа користени глувци на вродена позадина C57BL/6. Сите глувци беа одгледувани и сместени во објектот за лабораториски истражувања и ресурси за животни на Универзитетот Тексас А &M. Деталите за послабото управување со глувчето се опишани на друго место (Бава и Абот 2008). Користени се три машки и три женски глувци со див тип и хомозиготни послаби на четири постнатални возрасни групи (P10, P20, P30 и P40), додека споредбата со хомозиготно растурање е направена на P20 и P30. Процедурите за употреба на животни беа одобрени од страна на Тексас А &M Универзитетскиот лабораториски комитет за употреба на животни и спроведени во согласност со Националниот институт за здравствени водичи за грижа и употреба на лабораториски животни (Национален институт за здравствена публикација бр. 85-23, ревидиран 1996 година).

Клетките на гранулите на малиот мозок беа акутно изолирани и протоколот беше потврден со различни експерименти како што е детално опишано на друго место (Бава и Абот 2008). Накратко, на одредена возраст, глувците беа анестетизирани со употреба на изофлуран и убиени со обезглавување. Малиот мозок беше отстранет, исечен на мали парчиња и префрлен на 50 ml разладен минимален основен медиум со соли на Ерл (MEM Life Technologies Inc., Rockville, MD), потоа префрлен во МЕМ кој содржи 1,5 U/ml протеаза (Сигма, Сент Луис , МО, САД), и промешано. За време на мешањето, 0,2% ДНаза (Сигма) беше додадена за да се вари геномската ДНК ослободена од оштетените клетки. Медиумите што содржат ќелии беа центрифугирани на 1.000е 10 мин, а клетките беа повторно суспендирани во МЕМ.

За базално [Ca 2+]јас мерењата, акутно изолираниот CGC беа обложени на коморни слајдови (VWR, West Chester, PA, USA) и инкубирани на 37 ଌ 20 минути со 95% O2 и 5% СО2На Десет микролитри од 20% плуронска киселина (Сигма) беа додадени на 50 μg на Fura-2 AM и беа додадени во медиумите за да се постигне конечна концентрација од 5 μM. Cелиите беа инкубирани со Fura-2AM на 37 и#x000b0C за 30 мин. Дестестерификацијата на бојата беше извршена со миење на клетките двапати со свеж МЕМ и инкубирање на 37 и#x000b0C дополнителни 30 мин. По деестерификацијата, CGC беа чувани во медиум без фенол црвена боја (Сигма). Fura-2AM го менува интензитетот на флуоресценција различно на бранови должини на возбуда од 340 и 380 nm при врзување на Ca 2+. Клетките беа изложени на двојна ексцитација на 340 и 380 nm и флуоресценцијата беше следена на 510 nm. Флуоресцентни слики се добиени со помош на UV & 40 × објективи на микроскоп Олимп 1X-70 и камера со три чипови Хамамацу ORCA-ER со разладено полнење. Беа спроведени негативни и позитивни контроли за да се потврди експерименталниот дизајн како што е опишано во Бава и Абот (2008).

По мерење на базалните [Ca 2+]јас, констатиравме како CaВ2.1 калциумови канали кај послабите глувци се однесуваат кога се деполаризирани. Минливите Ca2+ беа евоцирани со деполаризација предизвикана од KCl ​​и беа сликани со употреба на Fura-2AM. Користени се пет глувци од див тип и пет послаби глувци. По мерење на базалните [Ca 2+]јас како што споменавме погоре, екстрацелуларниот KCl беше зголемен на 40 mM со суперфузија на гранулирани клетки со 20 μl од 1 mM KCl. K+ индуцираните минливи Ca2+ беа измерени 10 мин., А податоците покажуваа врв [Ca2+]јас се користеа за споредба со почетните базални нивоа. Податоците се изразени како врв [Ca 2+]јас минус почетниот базален [Ca 2+]јас нивоа, што се нарекува калциум минлив. Анализирани се минимум 3 𠄴 клетки од секое животно за секоја возрасна група и генотип.

Да се ​​демонстрира целокупниот процент на CaВ2,1 струја во послаби гранулирани клетки користевме специфичен CaВ2.1 блокатор на канали, ω-Агатоксин IVA (Peptide International, Louisville, KY). Акутно изолираниот CGC од P20 диви и послаби глувци беа натоварени со Fura-2AM. Клетките потоа се инкубираат во 200 nM ω-Агатоксин IVA 20 минути на собна температура, потоа деполаризиран со KCl. Врв [Ca 2+]јас пост -деполаризација е снимена, а податоците се изразени како врв [Ca2+]јас минус почетниот базален [Ca 2+]јас и се нарекува минлив калциум.

Снимање слика и Р-вредностите се пресметани со помош на Simple PCI Version 5.0.0.1503 Compix Inc. и Imaging System (Cranberry Township, PA). [Околу 2+]јас е одредено со равенката:

Позадината беше одземена од 340 и 380 интензитет на флуоресценција пред да се пресмета Р-вредност. Фмин и Фмакс укажуваат на интензитет на флуоресценција на 380 nm во отсуство на Ca 2+ и висок Ca 2+, соодветно. Рмин и Рмакс претставуваат сооднос на F340/380 во отсуство на Ca 2+ и високо Ca 2+, соодветно. Вредностите што се користат за Фмин/Фмакс, Рмин, и Рмакс беа 8,36, 0,2 и 8,47, соодветно, пресметани со помош на комплетот за калибрација на калциум (Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA).

Податоците се претставени како средство и#x000b1 стандардна грешка на просекот. Сите податоци беа анализирани со статистички софтвер SPSS (верзија 12.0.1 за прозорци) со употреба на општ линеарен модел (GLM)-униваријатна анализа на варијанса (ANOVA) на α = 0,05. Значајните разлики меѓу генотиповите беа интерпретирани со помош на пост-хок тестот на Туки за ХСД.

Средно базално [Ca 2+]јас податоците во CGC за време на постнаталниот развој се прикажани на сл. 1. GLM-униваријантна ANOVA посочи целокупна значајна разлика помеѓу генотиповите и постнаталните денови (П < 0.001). Нема значајна разлика во базалните [Ca 2+]јас беше забележано помеѓу див тип и послаб CGC на P10, додека базалниот [Ca 2+]јас на дивиот тип CGC во P10 беше значително намален во споредба со P20, P30 и P40 CGC од див тип. Ова може да се должи на развојниот израз на различни VGCC и нивните под -единици, од изразување на α и β подединици на CaВ2.1 Ca 2+ канал е најочигледен по P10, и нивната заедничка експресија е потребна за правилна функционалност на каналот (Tanaka et al. 1995). Почнувајќи од P20, имаше намален базален [Ca 2+]јас кај CGC на послаби глувци во споредба со CGC див тип според возраста (П < 0.001). Овие наоди се во контраст со витките клетки на Пуркиние, каде што базалните [Ca 2+]јас нивоата не се разликуваа од клетките Пуркиниеви од див тип според возраста (Дове et al. 1998). Ние шпекулираме дека оваа разлика може да се должи на различен тип на Ca 2+ канали присутни во CGC во споредба со Пуркиниевите клетки во кои 90% од струјата на калциум зависи од P/Q-тип VGCC. Повеќекратни VGCC се присутни во CGC кои би можеле различно да реагираат кај послабите глувци како форма на функционална компензација и да резултираат со изменета хомеостаза на Ca2+ и намалена базална [Ca2+]јас.

Средно базално [Ca 2+]јас во клетките на малиот гранул (CGC) за време на постнаталниот развој. Графиконот покажува средно базално [Ca 2+]јас податоци од изолирани CGC од диви (диви), послаби (Leaner) и растреперени (Tottering) глувци (н = 6). Базалниот [Ca 2+]јас нивото кај диви типови CGC беше значително повисоко отколку што беше забележано кај послабиот и растреперен CGC на P20 и P30 (П < 0.001). Исто така, имаше значителни разлики помеѓу диви и витки базални [Ca 2+]јас на P40 (П < 0.001). Сепак, нема значајна разлика во базалните [Ca 2+]јас беше забележан помеѓу див тип и послаб CGC на P10. “*” укажува на значителни разлики помеѓу дивиот тип и другите генотипови и “#” укажува на значителни разлики во групите глувци од див тип. Податоците беа анализирани со употреба на GLM-униваријатна анализа на варијанса на α = 0.05

Интересно е тоа што CGC на растреперени глувци, исто така, покажа намален базален [Ca 2+]јас нивоа во споредба со CGC од див тип (П < 0.001) и нивото не беше различно од послабиот CGC (П = 0,376). Бидејќи превртливото CGC на глувчето не покажува прекумерна смрт на невронските клетки, ова сугерира дека намален базален [Ca 2+]јас сам не е директно одговорен за смртта на невронските клетки кај послабиот CGC. Затоа, ние ги разгледавме минливите предизвикани од деполаризација на Ca 2+ во CGC за време на постнаталниот развој.

Деполаризацијата предизвикана од KCl ​​најчесто се користи за набудување на минливи Ca2+ во CGC. Беше спроведен контролен експеримент за да се види дали набудуваните промени во флуоресцентниот интензитет се должат на екстрацелуларниот прилив на Ca 2+. Изолираните CGC беа натоварени со Fura-2AM и беа деполаризирани со употреба на KCl и во присуство и отсуство на екстрацелуларен Ca 2+ во медиумот. Значително зголемување на [Ca 2+]јас беше забележано во гранулирани клетки и од диви тип и од послаби глувци деполаризирани со KCl во присуство на екстрацелуларен Ca 2+, додека значајно зголемување не беше забележано кај медиумите без Ca2+ (податоците не се прикажани). Временскиот тек на промена во [Ca 2+]јас по деполаризацијата на CGC со KCl се прикажани две фази. Првата фаза беше минлив врв, што претставуваше влез на Ca 2+ во клетките преку канали Ca 2+ и, најверојатно, предизвикано од калциум ослободување на калциум од интрацелуларните резерви. За време на втората фаза (т.е. фазата на платото), [Ca 2+]јас достигнува рамнотежа како резултат на континуирана деполаризација и континуирано тампонирање (Werth and Thayer 1994). Нашето експериментално поставување ги покажа и двете фази на деполаризација на Ca 2+ (податоците не се прикажани). Бевме заинтересирани само за првата фаза, минливиот калциум, кога имаше врв [Ca2+]јас да се разбере ефектот на послабата мутација врз цела ќелија Ca 2+ струи во CGC.

Општа линеарна модел-униваријатна анализа на ANOVA не покажа разлика во минливите Ca2+ помеѓу генотипови во сите возрасни групи. Имаше значителна разлика во минливите Ca2+ кај C10 од див тип P10 во споредба со CGC од глувци од див тип P20, P30 и P40 (Слика 2). Развојните промени забележани во струјата на Ca 2+ се релевантни за процесите на созревање и ексцитабилност на грануларните клетки. Нашиот резултат е во согласност со голем број докази кои сугерираат дека струите на Ca 2+ се пониски во незрелите гранулирани клетки (Рандал и Циен 1995). Кај P10, послабиот CGC ја покажа истата шема како P10 CGC од див тип, освен, за разлика од CGC од див тип, послабиот CGC не покажа разлика во минливите Ca2+ помеѓу P10 и P20 (Слика 2). Ова сугерира или одложено созревање на CGC или развојни дефекти поради CaВКаналска мутација од 2,1 тип кај послаби глувци.

Средни минливи премини на калциум во клетките на малиот гранул (CGC) на глувци од див тип (Диви) и послаби (Leaner) за време на постнаталниот развој. Графикон покажува просечни минливи податоци за Ca 2+ во послаби и диви типови CGC откако тие беа деполаризирани со употреба на 40 mM KCl. Анализирани се минимум 3 𠄴 клетки од секој глушец за секоја возрасна група и генотип. Немаше значајни разлики помеѓу дивиот тип и послабиот CGC за сите возрасни групи забележани. Меѓутоа, минливите Ca2+ во C10 од див тип P10 беа различни од целата група на див тип (“*”, П < 0.05) и Ca 2+ преодни кај P10 послабиот CGC беа различни од P30 и P40 (“ ** ”, П < 0,05). Податоците беа анализирани со употреба на GLM-униваријатна анализа на варијанса на α = 0.05

Нашите резултати сугерираат дека иако послабиот CGC има дисфункционален CaВ2.1 калциумови канали сепак нема голема промена во целокупните минливи Ca2+ помеѓу дивиот тип и послабата CGC пост-деполаризација. Ова значи дека или постои можна функционална компензација од други VGCC за дисфункционален CaВ2,1 канали или намален тампон Ca 2+ во CGC, така што зголеменото [Ca 2+]јас се јавува кај послабиот CGC не е ефикасно бафериран, што доведува до зголемени минливи Ca2+. Друга можност е присуството на двата гореспоменати механизми. Претходно забележавме намален израз на калетинин, главниот протеин за врзување на Ca 2+, во послаб CGC во споредба со грануларните клетки од див тип според возраста (Nahm et al. 2002). Намалениот израз на калетинин во витките гранулирани клетки може да го преувеличи одговорот на индуциран од К + [Ca 2+]јас зголемување поради помалиот тампон капацитет Ca 2+. Друго толкување може да биде тоа CaВ2.1 Ca 2+ канали не придонесуваат за голем дел од целата ќелија Ca 2+ струја во послабиот CGC. За да ја тестираме оваа хипотеза, ние го деполаризиравме CGC во присуство и отсуство на специфичниот CaВ2.1 блокатор на канали, ω-Агатоксин IV-A, за кој е познато дека ги блокира и струите Ca- 2 од типот P- и Q-тип врз основа на различна кинетика на инактивација и чувствителност (Рандал и Циен 1995).

Резултати со користење ω-Агатоксин IV-A покажа значително намалување од скоро 40% во деполаризацијата предизвикана од Ca 2+ минливи кај CGC на P20 диви тип глувци. Нашите податоци се согласни со претходниот извештај дека приближно 45% од тековната Ca 2+ во CGC може да се пресмета со CaВ2.1 VGCC (Рандал и Циен 1995). Меѓутоа, ω-Агатоксин IV-A не беше во можност значително да ги намали минливите на Ca 2+ предизвикани од деполаризација кај послабиот CGC (Слика 3). Иако, имаше 17% намалување на преодните третирани со агатоксин цела клетка Ca 2+ кај CGC на послаби глувци, одговорот не беше значително различен од минливите на Ca 2+ третирани со неагатоксин. Ова сугерира дека постои функционална компензација за CaВ2.1 калциумови канали од други VGCC.

Средниот Ca 2+ ги пренесува податоците од послабите и дивите типови на церебеларни гранули (CGC) откако биле инкубирани во присуство или отсуство на ω-Агатоксин IV-A и деполаризиран со KCl. Намалени минливи Ca 2+ беа забележани само кај диви (Диви), но не и во послаби (Leaner) CGC по инкубација со CaВ2.1 канален специфичен блокатор ω-Агатоксин IV-A (П < 0,05 н = 30). Податоците беа анализирани со употреба на GLM-униваријатна анализа на варијанса на α = 0.05

Видови канали кои компензираат за дисфункционален CaВ2.1 канали во послаб CGC не се познати. Невроните на ЦНС обично имаат разновидни подтипови на канали Ca2+ кои се преклопуваат во функција. Неодамна, Етергеј и сор. (2007) објави функционална зголемена регулација на CaВ1 (L-тип) канали за да се компензира намаленото CaВФункција од 2,1 канали во базалните неврони на предниот мозок од послаби глувци. Како и CGC и за разлика од Пуркиниевите клетки, основните неврони на предниот мозок поседуваат целосен комплемент на подтипови на канал Ca2+ (Etheredge et al. 2007). Слично на тоа, CaВСе покажа дека 2,2 канали (од типот N) ја компензираат намалената функција од типот Р кај глупавите глувци (Leenders et al. 2002). Калциумовиот канал од типот Т α1G се покажува дека подединицата е различно регулирана кај витките мали мозочни клетки Пуркиние и гранули (Нам и сор. 2005). Додека церебеларна Пуркиниевите клетки покажуваат зголемен α1G израз на подединица, CGCs покажуваат намален α1G израз на подединица (Nahm et al. 2005). Така, се чини дека генетската промена во CaВ2.1 Каналите Ca 2+ предизвикуваат различни последици во изразот и функциите на каналот Ca 2+ на церебеларниот Пуркиниев и грануларните клетки.

Како заклучок, за првпат известуваме за базална и деполаризација предизвикана [Ca2+]јас во CGC на послаби глувци користејќи ратиометриска боја Fura-2AM. Нашата студија покажа дека има намален базален [Ca 2+]јас во послабиот CGC, сепак, деполаризацијата предизвикана од Ca 2+ преодни кај послабиот CGC се слични со CGC од див тип што може да се припише, барем делумно, на намаленото тампонирање на Ca 2+ во CGC што беше претходно пријавено (Нам и сор. 2002 година). Сепак, блокирање на целиот CaВ2.1 Ca 2+ канали не ја намалија струјата на целата ќелија, што укажува на функционална компензација од други VGCC. Идните истражувања во оваа област ќе бидат разјаснување на VGCC кои компензираат за дисфункционален CaВ2.1 Ca 2+ канали во CGC на послаби глувци.


Ефекти на FK506 и Циклоспорин А врз митохондријална деполаризација предизвикана од калциум и цитосолен калциум кај астроцити и неврони

Оваа студија ја тестираше хипотезата дека чувствителноста на загубата на потенцијалот на митохондријалната мембрана предизвикана од Ca 2+ (Δ Ψm) и чувствителноста на загубата на инхибиторите на митохондријалната транзиција на порите (ПТП) се различни за неврони и астроцити. Примарните култури на кортикални неврони на стаорци и астроцити беа изложени на Ca2+ јонофор 4-Br-A23187 и Δ Ψm беа следени со флуоресцентна сонда тетраметилродамин метил естер (TMRM). Ca 2+ јонофор предизвика пад на Δ Ψm кај двата типа на клетки што беше делумно инхибиран од циклоспорин А (CsA) кај астроцитите, но не и кај невроните. Друг инхибитор на ПТП, 2-аминоетокси-дифенилборат, беше неефикасен во заштитата од митохондријална деполаризација, но деполаризацијата беше инхибирана со FK506, имуносупресивен лек сличен на CsA кој не го инхибира PTP. CsA и FK506 значително го намалија зголемувањето предизвикано од јонофор во [Ca2+]јас и во невроните и во астроцитите. Заклучуваме дека заштитните ефекти на CsA и FK506 против деполаризацијата на митохондријалната мембрана предизвикана од Ca 2+ во непроменети астроцити не се должи на инхибиција на ПТП, туку е веројатно последица на инхибиција на порастот на [Ca 2+]јас.


Апстракт

Влошувањето на секрецијата на инсулин и бета-клеточната маса на панкреасот со воспалителни напади е една од главните патофизиолошки карактеристики на дијабетес тип 2 (Т2Д). Затоа, зачувувањето на бета-клеточната маса и стимулирање на секреција на инсулин само како одговор на гликозата за да се избегнат ризиците од хипогликемија, се најсовремена опција за третман на Т2Д. Во оваа студија тестиравме две поврзани хипотези дека 1/ ендогениот пептид ослободен од сортилин, познат како PE, кој го стимулира лачењето на инсулин само како одговор на гликозата, ги штити бета-клетките од смрт предизвикана од цитокини и 2/ Спадин и Мини-Спадин , два синтетички пептиди добиени од PE, кои ги имитираат ефектите на PE во секрецијата на инсулин, исто така, обезбедуваат корисен ефект врз опстанокот на бета-клетките. Покажуваме дека ЈП и неговите деривати со поттикнување на пораст на интрацелуларната концентрација на калциум со деполаризација на мембраната ги штитат бета-клетките од смрт предизвикана од Интерлеукин-1β. Користејќи биохемиски, конфокални слики и клеточна биолошка техника, откриваме дека заштитните ефекти на ЈП и неговите деривати се потпираат на активирање на патеката CaM-Киназа, како и на фосфорилација и активирање на транскрипциониот фактор CREB. Покрај тоа, Мини-Спадин промовира пролиферација на бета-клетки, што укажува на неговиот можен регенеративен ефект. Оваа студија ги истакнува новите можни улоги на ЈП во опстанокот на бета-клетките на панкреасот и неговите деривати како фармаколошки алатки против дијабетес.


Толкување на анализа на деполаризација/калциум на ФУРА - психологија

Двонасочно сигнализирање помеѓу рецепторот на јанодин тип 1 (RyR1) и дихидропиридин рецепторот (DHPR) во скелетните мускули служи како истакнат пример за конформациона спојка. Неодамна беа презентирани докази за физиолошки механизам дека по деполаризација на миотубите цврсто се поврзуваат три калциумови канали, DHPR, RyR1 и канал за влез Ca 2+ со својства слични на SOCC (Чередниченко, Г., Хурн, А.М., Фесенден, Ј.Д.) , Ли, ЕХ, Ален, ПД, Бим, КГ и Песа, ИН (2004) Прок. Натл. Акад Наука САД. 101, 15793-15798). Оваа форма на конформациона спојка, наречена влез на калциум поврзан со побудување (ECCE) е предизвикана од α1s-DHPR сензор за напон и е многу зависен од RyR1 конформацијата. Во овој извештај, ние ги заменуваме цистеините RyR1 4958 или 4961 во рамките на ТXМотивот CFICG, заеднички за сите канали ER/SR Ca 2+, со серин. Кога се изразени во скелетни миотуби, C4958S- и C4961S-RyR1 правилно ја таргетираат и враќаат струјата од типот L преку DHPR. Меѓутоа, овие мутанти не реагираат на RyR активаторите и не поддржуваат скелетен тип EC спојка. Како и да е, деполаризацијата на клетките што изразуваат C4958S- или C4961S-RyR1 предизвикува влез на калциум преку ECCE што наликува на онаа за дивиот тип RyR1, освен за значително забавена кинетика на инактивација и деактивирање. ECCE во овие клетки е потполно независно од исцрпување на залихите, прикажува селективност на катјони на Ca 2+ & gtSr 2+ ∼Ba 2+ и е целосно инхибирана од SKF-96365 или 2-APB. Мутација на други не-ЦXXЦ мотивите цистеини во рамките на трансмембранскиот склоп RyR1 (C3635S, C4876S и C4882S) не го повторија фенотипот забележан кај C4958S- и C4961S-RyR1. Оваа студија ја покажува суштинската улога на Cys 4958 и Cys 4961 во рамките на непроменливата ЦXXC мотив за стабилизирање на конформациите на RyR1 кои влијаат и на неговата функција како канал за ослободување и на неговата интеракција со ECCE каналите.

Оваа работа беше поддржана од Националните институти за здравствени грантови 2P0 AR17605, 1P0ES11269 и 2R01 AR43140. Трошоците за објавување на овој напис делумно се покријат со плаќање на трошоци за страница. Затоа, овој напис мора да биде означен со ова „реклама“Во согласност со 18 U.S.C. Дел 1734 само за да го посочи овој факт.

Двајцата автори дадоа еднаков придонес за ова дело.

Сегашно обраќање: Оддел за фармакологија, Универзитет во Вашингтон, Сиетл, WA 98195.


Апстракт

Влошувањето на секрецијата на инсулин и бета-клеточната маса на панкреасот со воспалителни напади е една од главните патофизиолошки карактеристики на дијабетес тип 2 (Т2Д). Затоа, зачувувањето на бета-клеточната маса и стимулирање на секреција на инсулин само како одговор на гликозата за да се избегнат ризиците од хипогликемија, се најсовремена опција за третман на Т2Д. Во оваа студија тестиравме две поврзани хипотези дека 1/ ендогениот пептид ослободен од сортилин, познат како PE, кој го стимулира лачењето на инсулин само како одговор на гликозата, ги штити бета-клетките од смрт предизвикана од цитокини и 2/ Спадин и Мини-Спадин , два синтетички пептиди добиени од PE, кои ги имитираат ефектите на PE во секрецијата на инсулин, исто така, обезбедуваат корисен ефект врз опстанокот на бета-клетките. Покажуваме дека ЈП и неговите деривати со поттикнување на пораст на интрацелуларната концентрација на калциум со деполаризација на мембраната ги штитат бета-клетките од смрт предизвикана од Интерлеукин-1β. Користејќи биохемиски, конфокални слики и клеточна биолошка техника, откриваме дека заштитните ефекти на ЈП и неговите деривати се потпираат на активирање на патеката CaM-Киназа, како и на фосфорилација и активирање на транскрипциониот фактор CREB. Покрај тоа, Мини-Спадин промовира пролиферација на бета-клетки, што укажува на неговиот можен регенеративен ефект. Оваа студија ги истакнува новите можни улоги на ЈП во опстанокот на бета-клетките на панкреасот и неговите деривати како фармаколошки алатки против дијабетес.


Распространети HTS методи за специфичните семејства на јонски канали

Пред да изберете идеален метод (и) за скрининг, важно е да одредите што да барате кога ги споредувате технологиите и нивните апликации. Осум параметри кои најчесто се разгледуваат вклучуваат чувствителност, специфичност, проток, временска резолуција, робусност, флексибилност, цена и физиолошка важност. Меѓу сите формати на анализа на јонски канали, несомнено, автоматската анализа на стегач за закрпи е најдобриот избор што обезбедува добар квалитет на податоците и овозможува поголем проток. Во моментов, автоматската анализа на електрофизиологија останува скапа. Така, не секоја лабораторија може да си го дозволи тоа. Затоа, како компромис, комбинацијата на технологии за скрининг базирани на флуоресценција и автоматска стегач за печ стана најчесто користениот метод за откривање на лекови насочени кон јонски канали. Со намалување на трошоците и подобрување на технологијата, автоматизираната електрофизиологија ќе стане доминантен формат на анализа за повеќето подтипови на јонски канали. За различни подкласи на јонски канали, методите на скрининг со голема пропусност се разликуваат поради селективноста на јони, кинетика за активирање на канали и разгледување дали е потребен лиганд. За избрана цел на јонски канали, дијаграмот на проток на скрининг со голема моќност е сумиран на Слика 1. Поделен е во 3 фази: анализа базирана на флуоресценција за примарен скрининг, автоматизирана валидација на стегач за секундарен скрининг и рачно карактеризирање на закрпи за терцијарен скрининг. Бидејќи постојат многу фамилии и подкласи на јонски канали, најчесто користените методи на скрининг ќе се дискутираат врз основа на јонска селективност или пропустливост. Дијаграмите за репрезентативните методи на скрининг се прикажани на слика 2.

Гасовод со високопропусен скрининг насочувајќи јонски канали. (А) За голема библиотека со соединенија, соединенијата прво се прикажуваат со помош на анализа на флукс базирана на флуоресценција на стабилна клеточна линија изразена од јонски канали, а идентификуваните удари се потврдуваат на истите клетки и се контра-прикажани на родителските клетки да се исклучат неспецифични хитови. (Б) Второ, активните удари се тестираат со помош на автоматизирана стега за закрпи за валидација и, активните удари се фармаколошки оценети за односот структура-активност (САР) додека не се идентификуваат соединенијата на олово. (В) Конечно, рачна клешта за закрпи се користи за да се карактеризираат биофизичките својства на стабилните клеточни линии и мајчините клетки.

Дијаграм на методи за скрининг со голема пропусност. (А) Дијаграм на анализа на талиум-флукс за канали на калиум, затворена состојба, отворена состојба и сиров сигнал. За калиумски канал, анализата на Tl + -флукс е најчесто користениот формат на анализа. За да се активира каналот, обично се користи раствор со висок К + за да се деполаризира потенцијалот на мембраната. Потоа, талиумот поминува во клетките преку отворени канали за калиум. Кога цитозолниот талиум се врзува за бојата, сигналот за флуоресценција е кинетички зголемен. Суровите траги се добиени од примарниот скрининг на калиумските канали KCNQ2. Црните, црвените и сините сурови траги претставуваат ефект на тампон контрола, активатор и инхибитор, соодветно. (Б) Дијаграм на анализа на флукс на калциум за канали зафатени со калциум. Флуо-4 е најчесто користениот индикатор за калциум за канали вклучени во калциум. За да се активира поврзаниот канал, се користи високо-Ca 2+ или агонист на каналот за да се отвори каналот или да се зголеми цитосолот Ca 2+. Суровите податоци се добиени од примарниот скрининг на каналот TRPC4. За скрининг на повеќе класи модулатори, беа применети три додавања за истиот бунар. Првиот додаток е за прикажаните соединенија без ДАМГО (високо селективен пептиден агонист за μ опиоидниот рецептор) за скрининг на агонист. Второто дополнување е ЕК20 концентрација на DAMGO за алостерични модулатори. Третото дополнување е ЕК80 концентрација на DAMGO за антагонисти.Црните траги претставуваат соединенија без никаков ефект на трите додавања. Црвените траги претставуваат соединенија со агонистички ефект. Сините траги претставуваат соединенија со антагонистички ефект. (В) Дијаграм на канали селективни за хлорид. Мутираниот YFP (H148Q и I152L) беше ко-изразен со канали за селектирање на хлорид. Кога каналот се отвора, јодидот влегува во клетките преку канали на хлорид, се врзува за YFP и ја гаси неговата флуоресценција. Суровите податоци се добиени од примарниот скрининг на калциум-активиран канал на хлорид (TMEM16A). Иномицин се користеше како агонист за активирање на каналот. Црвената трага ги претставува каналите активирани со јономицин. Сината трага го претставува ефектот на инхибитор.

Канали за селектирање на калиум

Каналите кои селектираат калиум се најголемата и најразновидната група меѓу семејствата на јонските канали. Класите на канали вклучуваат напонски затворени (Кс), навнатре-исправувачки (КIR), двопорна (К2P) и активирано со Ca 2+ (КCa) калиумови канали. Повеќе формати на анализи се применети на ова големо семејство, вклучувајќи го и тестот за врзување на лиганд, 86 Rb + анализа на флукс, анализа на боја осетлива на напон и анализа на флукс на Tl +. Меѓу нив, анализата на флуксот Tl + најчесто се користи за идентификување на модулатори на калиумски канали 24. Во оваа анализа, Tl + се користи како сурогат јон за K +, а неговиот прилив во клетките првично се мери со употреба на флуоресцентна боја осетлива на талиум, бензотиазол (БТК) 24,50, што е Ca 2+ индикатор со низок Ca 2+ -врзувачки афинитет (Кг= 7 μmol/L). Користејќи комерцијално достапен комплет за анализа на талиум (FluxOR ™, Life Technologies), методот е успешно развиен за голем број калиумски канали. Анализата на флуксот Tl + е широко користена во скринингот на калиумовите канали, како што е Кс 24,51,52,53,54,55,56, КIR 57,58,59, К2P 60,61,62 и КCa 63,64 канали. Треба да се напомене дека различни патеки надвор од целта (на пр, Na + /K + ATPase) од мајчин HEK-293 или CHO-K1 (овие два типа на родителски клетки најчесто се користат) клетките би можеле да го попречат приливот на Tl +, што ќе предизвика повисока лажно-позитивна или лажно-негативна хит стапка. Затоа, неопходен е контра -скрининг против родителските клетки за да се елиминираат лажните удари што комуницираат со родителските клетки. Покрај тоа, анализата треба да се постапува со голема претпазливост поради токсичноста на талиумот.

Ca 2+ вклучени јонски канали

Интрацелуларниот јон на калциум (Ca 2+) е универзален втор гласник кој ги контролира и физиолошките и патолошките процеси. Меѓу споменатите јонски индикатори, индикаторите за калциум најчесто се користат 65 бидејќи ја менуваат нивната емисија на флуоресценција при врзување на калциумот. Во моментов, достапни се над сто индикатори за хемиски синтетизирани и генетски кодирани 66. Хемиските показатели кои најчесто се користат вклучуваат Фура-2, Индо-1, Флуо-3 и Флуо-4, кои се деривати на селективен хелатор Ca 2+ БАПТА 30,67.

Во зависност од апликацијата, боите на калциум се достапни во различни афинитети со јони на калциум 68, спектар на возбуда и емисија и хемиски форми (пропустливи за мембрана или не). Тие покажуваат различна временска резолуција (од милисекунди, како што се Флуо-3 и Флуо-4, до десетици секунди, како што е Фура-2) и различни степени на точност за секој опсег на концентрации на калциум. На пример, Индо-1 е подобар од Флуо-3 за мерење на големи и релативно бавни интрацелуларни транзиенти на калциум кои се поврзани со клеточна контракција. Спротивно на тоа, Fluo-3 е најпосакуван за мерење мали, брзи преодни врски поврзани со „искри“ на калциум 69. Затоа, Fluo-3 (вклучувајќи го и неговиот дериват Fluo-4) е посоодветен за откривање на сигнали на јонски канали вклучени во Ca2+. За скрининг со висока пропусност на јонски канали вклучени Ca 2+, достапни се комерцијални комплети, како што се комплетите за анализа на калциум Fluo-4 (Life Technologies). Тие се широко применети во анализи на јонски канали вклучени Ca2+, како што се калциумови канали со напон 33,70, TRP канали 71,72,73,74,75 и NMDA рецептори 76,77.

Понатаму, калциумовите канали постојат меѓу затворени, отворени и инактивирани состојби. За да се разликуваат инхибиторите зависни од состојбата, обично генот на внатрешниот исправувач на калиумски канал (на пр, Кир2.3) е ко-изразен со калциумови канали. Така, потенцијалот на мембраната може да се прилагоди со менување на надворешните концентрации на К +. Овој пристап успешно се користи за да се идентификуваат инхибитори зависни од состојбата и да се карактеризира молекуларната селективност, дури и да се понудат некои предности во однос на електрофизиологијата 33,41. Стратегијата може да се примени и на натриумовите канали. Анализите на јонски канали базирани на боја на калциум страдаат од мешање од други клеточни процеси кои предизвикуваат промени во интрацелуларната концентрација на калциум. Контра скринингот за истата анализа треба да се спроведе против родителските клетки за да се отстранат неспецифичните соединенија.

Натриумски канали со напон

Натриумските канали со напон се важни цели за лекување на возбудливи болести, како што се епилепсија и невропатска болка. Познато е дека натриумските канали со напон се затворени во затворени, отворени и инактивирани состојби. Дополнително, за натриумовите канали изразени во клетките ХЕК-293, мембранскиот потенцијал е на подеполаризирано ниво. Земајќи го подтипот на натриумовиот канал Nav1.7 изразен во HEK-293 клетки како пример, просечниот мембрански потенцијал е измерен да биде приближно −24 mV, просечна вредност од панел од приближно 50 клетки (податоците не се објавени). Така, ова ќе ги доведе повеќето канали во инактивирани состојби, наместо нивните вистински „состојби во мирување“. Затоа, познат инхибитор на инактивација на Nav, вератридин 78, најчесто се користи за отворање на каналите, што произведува посилен сигнал.

Идеално, јонските селективни индикатори се совршени за анализа на специфичните јонски канали. Сепак, достапните осетливи бои за Na + (на пр, SBFI 26, бои CoroNa 79 и Asante Natrium Green-2 80) не се добро прилагодени за скрининг со голема пропустливост поради ниската чувствителност и слабиот сооднос сигнал-позадина. Анализа на потенцијална боја на мембрана базирана на флуоресценција (на пр, DiBAC и FRET бои) често се користи за скрининг на натриумски канали. За самата анализа, промената на сигналот првенствено е под влијание на мембранскиот потенцијал. Затоа, секој настан што го менува потенцијалот на мембраната ги модулира сигналите. Така, методот базиран на боја може да даде релативно висока лажно-позитивна и/или лажно-негативна стапка во споредба со електрофизиолошките методи. Неодамна, методот заснован на флукс на талиум (Tl + флукс) 81, вредна техника за калиумови канали, успешно е развиен како функционална анализа за натриумските канали Nav1.7. Методите на флукс на Tl + создаваат драматично поголеми сигнали, кои се супериорни во однос на најсовремените осетливи на Na + бои и се подложни на HTS на натриумовите канали. Примена на лиганди (на пр, вератридин) може да комуницира со испитуваните соединенија и со тоа да ги зголеми стапките на лажно-позитивни или лажно-негативни. Покрај тоа, новоразвиена анализа на флукс на калциум (анализа SoCal) 82 се користи како отчитување на функционалната промена на Nav каналите. Во оваа анализа, каналите Nav беа генетски дизајнирани за да произведат постојани Nav струи со нарушена брза инактивација и зголемена пропустливост на калциум. Така, известувачите за калциум, вклучувајќи ги и хемиските бои и генетски кодираните сензори, ќе бидат алтернативни показатели за каналите Nav. Иако анализата SoCal покажува добра проценка на активноста за огромното мнозинство тестирани соединенија, сепак се препорачува хитовите дополнително да се потврдат со помош на електрофизиолошка метода во канали за диви видови Nav. Поради ограниченоста во контролирањето на состојбата на натриумовите канали во споредба со електрофизиологијата, треба да се внимава при толкување на податоците за инхибиторите од пристапот базиран на флуоресценција.

Канали селективни за хлорид

За канали со хлорид, развиена е анализата за гаснење на жолт флуоресцентен протеин (YFP) 27. Првично, YFP-H148Q имаше поголема селективност за јодид (I-) отколку хлорид (Cl-) поради својствата за врзување на халид на YFP 27. Сепак, H148Q бара значителни концентрации на јодид за да се произведе прифатлив сигнал, што ќе манифестира клеточна токсичност. Пристапот на случајна мутација, YFP-I152L, има значително зголемена чувствителност на јодид 27,29. Така, YFP (H148Q и I152L) во комбинација со јодид беше широко користен за скрининг на хлоридниот канал. При активирање на хлоридниот канал, I152L влегува во клетките, се врзува за YFP и ја гаси неговата флуоресценција. Потоа, гасењето зависно од агонисти на флуоресценција на YFP може да се измери со читач на флуоресценција и да се користи за одредување на активирање, инхибиција и модулација на каналот. YFP анализата е неинвазивна техника која ги мери брзите реакции. Анализата е широко развиена за селективни канали и рецептори за хлорид, вклучувајќи CFTR 83,84, калциум-активирани Cl-канали (CaCC) (TMEM16A) 85,86,87,88, рецептори за глицин 89 и GABA рецептори 89,90. Дополнително, методот на обојување чувствителен на напон може да се користи за испитување на каналите на хлорид, но ретко се користи за оваа класа канали.

Бидејќи потенцијалот на мембраната не може да се контролира како електрофизиолошки анализи во гореспоменатите анализи базирани на флуоресценција, образложението е да се подобри односот сигнал-бучава за време на развојот на анализата на HTS. Општо земено, постојат два пристапи за подобрување на односот сигнал-шум: зголемување на сигналот или намалување на бучавата. Сигналот може да се зголеми со создавање услови под кои се отвораат повеќе канали. Ова може да се постигне со примена на висок К + за да се предизвика деполаризација на мембраната или со примена на лиганди за возење на каналите во поактивирани состојби. Бучавата може ефикасно да се намали со помош на нефизиолошки сурогат јони, како што е талиум за К + и јодид за Cl-. Овие сурогат јони се речиси непостоечки во клетките и затоа нивното ниво на бучава е многу ниско. Дури и мала количина интрацелуларна промена на овие сурогатни јони може лесно да се открие.


2. Флуоресцентни анализи со користење на мембрански потенцијални осетливи бои

2.1 Преглед на анализа

Јонските канали претставуваат класа протеини со потенцијал за терапевтска интервенција. Хуманите генетски студии идентификуваа цели на јонски канали кои се релевантни за лекување на специфични болести со јасно исполнети клинички потреби. Покрај тоа, постои фармаколошка валидација за други цели на јонски канали поврзани со медицински состојби кои не се добро третирани со тековните лекови. Предизвикот за полето на јонски канали е да се идентификуваат потентни и селективни модулатори на јонски канали со соодветни карактеристики што ќе овозможат нивна евалуација во клиничките испитувања. Значително подобрување на технологијата во последните неколку години со автоматизирани електрофизиолошки инструменти обезбеди дополнителни платформи кои можат да го поддржат развојот на лекови за јонски канали. Сепак, ниту еден од овие инструменти с can уште не може да поддржи скрининг на големи хемиски библиотеки (т.е. > 1 М соединенија) кои обично се потребни за да се идентификуваат нови водечки кандидати за цели на јонски канали на кои им недостасуваат остварливи сонди или води. Покрај тоа, високата цена на автоматизираните потрошни материјали за електрофизиологија бара потрага по алтернативни технологии за мерење на активностите на јонските канали во формати со висока густина. Иако овие технологии не можат да ја заменат електрофизиолошката евалуација на понапредните кандидати за лекови, тие можат да играат важна улога во идентификацијата и оптимизацијата на олово.

Бидејќи јонските канали продираат во јони со голема брзина кога се отвораат, затоа активноста на овие протеини може да предизвика промени во напонот на мембраната. Кога се правилно подесени, активноста на јонските канали изразена во клетките на цицачите може индиректно да се следи со употреба на мембрански потенцијални обојувачки бои кои обезбедуваат сигнал за флуоресценција. Овие анализи можат да работат во формати на плочи со 96-, 384- или 1536 бунари со пониска цена и поголем проток од моментално достапните автоматски електрофизиолошки платформи. Меѓутоа, за да бидат корисни анализи базирани на потенцијал на мембрана, мора да се применат ригорозни критериуми за валидација за да се осигура дека сигналот за флуоресценција обезбедува сигурно мерење на активноста на каналот. Пренос на енергија со флуоресцентна резонанца (FRET) со употреба на пар бои, кумарин закотвен со фосфолипиди и хидрофобен оксанол кој брзо се дистрибуира во мембраната според трансмембранското поле, може да обезбеди силни и репродуктивни сигнали при проучување на напонската активност. затворен натриум, калиум и други канали. Навистина, анализата може да се намести за да се идентификуваат или активатори или инхибитори на даден јонски канал. Општиот концепт при дизајнирање анализи за инхибитори на калиумови канали е илустриран подолу на Слика 1.

Слика 1:

Флуоресцентна база на мембрански формат за потенцијален анализа за откривање на инхибитори на калиумски канали. Флуоресцентни бои се користат за мерење на деполаризација на клетките по додавање на висока концентрација на калиум во екстрацелуларниот раствор. Голема деполаризација (повеќе.)

Конструирани се клеточни линии што го изразуваат калиумскиот канал од интерес. Во овие ќелии, стабилно изразениот канал го поставува потенцијалот за одмор

-90 mV Под контролни услови, додавање на раствор со висок калиум ќе предизвика деполаризација на клетките, а оваа промена на напонот може да се измери со фрејтите ФРЕТ. Во илустрираниот пример, сино-црвените флуоресцентни сигнали претставуваат емисија на N- (6-Хлоро-7-хидроксикумарин-3-карбонил) -димиристоилфосфатидилетаноламин (CC2 𠄝MPE) и бис- (1,3-дитилтиобарбиторен киселина) триметит (DiSBAC2 (3)), соодветно, додека зелениот сигнал го претставува односот на CC2 𠄝MPE на DiSBAC2(3). Може да се види дека по додавање на висок раствор на калиум (горните панели на слика 1), интензитетот на емисијата на DiSBAC2(3) се намалува поради движењето на бојата кон внатрешниот лист на мембраната. Како последица на тоа, се зголемува емисијата на CC2 𠄝MPE и се воспоставува нов сооднос на флуоресценција. Кога клетките се претходно инкубирани со инхибитор на калиумски канали (долните панели на слика 1), ќе се појави деполаризација на клетките и понатамошното додавање на раствор со висок калиум нема да влијае на FRET сигналот. Така, може да се воспостави голем сигнал за анализа за идентификување на инхибитори на канали. Овој дизајн на анализа работи добро и со калиумски канали со напон и со напон.

За идентификување на активатори на калиумски канали, следниот концепт на анализа може да се користи како што е прикажано на Слика 2.

Слика 2:

Флуоресцентна база на мембрански формат за потенцијален анализа за откривање активатори на калиумски канали. Флуоресцентни бои се користат за мерење на деполаризација на клетките по додавање на висока концентрација на калиум во екстрацелуларниот раствор. Калиумот предизвикува (повеќе.)

Конструирани се мобилни линии што го изразуваат каналот на интерес. Во овие клетки, изразениот калиум канал не е способен да го постави потенцијалот за одмор поради комбинација на ниски нивоа на изразување и/или ниска веројатност за отворање, а потенцијалот на клеточната мембрана е воспоставен во близина на нула mV. Меѓутоа, во присуство на активатор на канал (агонист) кој ја зголемува веројатноста за отворање на каналот, потенцијалот на клеточната мембрана ќе стане хиперполаризиран со поместување кон потенцијалот за рамнотежа на калиум. По додавање на раствор со висок калиум, контролните ќелии нема да прикажат промена во сигналот FRET, додека голема промена во FRET ќе се забележи во оние бунари во кои е присутен активатор на канали. Во илустрираниот пример, сино -црвените флуоресцентни сигнали претставуваат емисија на CC2 𠄝MPE и DiSBAC2(3), соодветно, додека зелениот сигнал го претставува односот на CC2 𠄝MPE на DiSBAC2(3).

Анализата што се користи за идентификација на инхибитори на натриумските канали со напон (Nav) може да се спроведе со помош на следнава шема прикажана на слика 3.

Слика 3:

Флуоресцентна база на мембрански формат за потенцијален анализа за откривање на инхибитори на натриумски канали со напон. Се користи агонист на натриумски канали (вератридин) за отстранување на инактивација на каналот што доведува до наплив на натриум и клеточна деполаризација измерена со флуоресцентна (повеќе.)

Кај клетките на цицачите, стабилно изразените Nav канали престојуваат главно во не-проводна инактивирана состојба поради деполаризираниот потенцијал на мембраната за одмор на клетките (-20 до -50 mV), бидејќи натриумовите канали брзо се отвораат, потоа се инактивираат и остануваат затворени како одговор на мембрана деполаризација На Сепак, се смета дека оваа конформација на каналот претставува висока афинитетна состојба за интеракција со некои класи инхибитори, а исто така се смета дека е поизразена во некои состојби на болести. Изложеноста на клетките на Nav агонист, како што е вератридин, ја отстранува инактивацијата и овозможува влез на натриумови јони во клетките преку отворени, неблокирани канали, предизвикувајќи деполаризација на клетките кон потенцијалот за рамнотежа на натриум, со последователна промена на сигналот FRET. Во илустрираниот пример, сино -црвените флуоресцентни сигнали претставуваат емисија на CC2 𠄝MPE и DiSBAC2(3), соодветно, додека зелениот сигнал го претставува односот на CC2 𠄝MPE на DiSBAC2(3), и индивидуални бунарски одговори на зголемена концентрација на вератридин се прикажани. Во присуство на Nav инхибитор, FRET сигналот ќе биде непроменет по додавањето на Nav агонистот, бидејќи рамнотежата на каналот би била поместена кон инактивирана состојба поврзана со лекови, која може да не се отвори додека инхибиторот не се дисоцира. Важно е да се одреди оптимална концентрација на вератридин што дава силен сигнал, додека не влијае значително на чувствителноста на инхибиторите. Овој формат на анализа работи добро за неколку Nav1.X канали, иако вистинскиот агонист што се користи за да започне натриум прилив варира во зависност од каналот што се испитува.

2.2. Општи размислувања

Анализите опишани погоре можат да обезбедат силни, репродуктивни сигнали и да работат со високи Z ’ фактори во плочи со 96, 384 и 1536 бунари. Особено внимание на условите за клеточна култура е критично за успехот на анализата. Cелиите треба да бидат слични, но не и обраснати, за анализата да работи правилно. Операторот треба да ги идентификува условите за раст на клетката и густината на обложување на клетки кои се соодветни за да се обезбеди добар сигнал за анализа. Ракувањето со боите е исто така важно бидејќи овие молекули се липофилни по природа и понекогаш е тешко да се стават во раствор. Забележано е врзување на овие реагенси за пластични површини и затоа е подобро да се користат стаклени површини за подготовка на бои и решенија#x02019.

2.3. Мобилни линии

Анализите опишани погоре можат да обезбедат силни, репродуктивни сигнали и да работат со високи Z ’ фактори во плочи со 96, 384 и 1536 бунари. Особено внимание на условите за клеточна култура е критично за успехот на анализата. Cелиите треба да бидат слични, но не и обраснати, за анализата да работи правилно. Операторот треба да ги идентификува условите за раст на клетката и густината на обложување на клетки кои се соодветни за да се обезбеди добар сигнал за анализа. Ракувањето со боите е исто така важно бидејќи овие молекули се липофилни по природа и понекогаш е тешко да се стават во раствор. Забележано е врзување на овие реагенси за пластични површини и затоа е подобро да се користат стаклени површини за подготовка на бои и решенија#x02019.

2.4. Параметри на анализа

За време на оптимизацијата на анализата, клучен почетен експеримент е да се оцени матрицата на концентрации на боја за да се идентификуваат оние што се оптимални за одредената клеточна линија и анализа што се разгледува. Покрај репродуктивноста и високите Z ’ фактори, секоја анализа треба дополнително да се потврди со употреба на фармаколошки модулатори за канали. Различни структурни класи и механизми на дејствување треба да прикажуваат ефекти што одговараат на својствата забележани во електрофизиолошките или други добро дефинирани биохемиски експерименти. Ако не, промените во параметрите на анализата треба да се истражат за да се постигнат најоптималните услови. На пример, за каналите Nav, концентрацијата на агонисти е од клучно значење за да се обезбеди фармаколошко отчитување кое добро корелира со електрофизиолошките вредности. Кога концентрацијата на агонисти е превисока, поместување на кривите концентрација-одговор на инхибиторите кон повисока IC50 ќе се појават вредности, па дури и може значително да влијае на одговорот на одредени структурни класи на инхибитори на таков начин што анализата ќе стане нечувствителна на присуството на овие агенси. Кривата на концентрација-одговор на агонист, како на пример погоре илустрираниот пример со вератридин, треба да се изведува секојдневно за да се идентификува состојбата што обезбедува силен, но не заситен сигнал. Бидејќи кривините на концентрација-одговор на агонист се доста стрмни, не е можно да се погоди оптималната концентрација на агонист за дадена анализа, бидејќи други фактори, како што е специфичната состојба на клетките, можат да влијаат на одговорот. Општо земено, времето на пред-инкубација од 30 минути со тест соединение се чини дека е оптимално. Подолгото време на инкубација од 45 минути може да започне да ја загрозува верноста на анализата најверојатно поради проблеми поврзани со токсичност од употребата на бои.

Сите плочи за анализа секогаш треба да содржат соодветни контроли. Плочите што не се во согласност со минималниот фактор Z ’ треба да се отфрлат. За време на оптимизацијата на олово, мора да се вклучат кривите на концентрација-одговор на стандардните модулатори на канали за да се осигура дека фармаколошките одговори на новите соединенија се значајни. Особено внимание мора да се посвети на бунарите поставени на рабовите на плочата. Ако има какви било проблеми со сигналите за анализа од овие работни бунари, тогаш проблемот треба да се поправи или инаку овие бунари не треба да се земат предвид при пресметување на податоците. Употребата на неколку копии по точка на податоци обезбедува поголема точност кога се користи равенка на Хил со четири параметри за да се пресмета IC50 или ЕЗ50 вредности.

2.5. Анализа на податоци

Во анализите за калиумски канали, одговорите на сигналот FRET на додавање на раствор со висок калиум се одраз на мембранскиот потенцијал на клетките пред ова додавање. Така, во овие анализи, сигналот за сооднос на флуоресценција на платото се користи за пресметување на ИЦ50 или ЕЗ50 вредности за инхибитори на канали или активатори. Во принцип, сигналот за сооднос на флуоресценција на платото останува стабилен значителен временски период, така што нема проблеми при користење на овој пристап. Кога се анализираат Nav каналите, ситуацијата е поинаква. Во овој случај, промената на потенцијалот на мембраната се активира со додавање на одреден Nav активатор. Идеално, некој би сакал да ја измери почетната стапка на промена на сигналот што треба да биде поврзана со бројот на функционални Nav канали. Меѓутоа, наклонот на сигналот FRET може да не е строго поврзан со бројот на модифицирани функционални канали и може да биде ограничен со временскиот одговор на боите и/или инструментот. Поради оваа причина, временски интервал од 3 секунди е идентификуван во контролните бунари каде што сигналот започнува да се приближува (

95%) ниво на плато. Овој ист временски интервал потоа се користи за да се одреди ефектот на тест соединенијата.

Сите најчесто користени критериуми за пресметување статистички значајни параметри од кривите на концентрација-одговор на соединенијата треба да се применат за пресметка на податоците.


Соматски сигнали за калциум: за неврони со високи стапки на отпуштање

Некои неврони, како што се ГАБАергичните клетки со брзо шилење во неокортексот, имаат високи стапки на отпуштање. Иако заклучокот станува с difficult потежок, снимањето на калциум с still уште може да биде атрактивен пристап, бидејќи некои подтипови на интерневрони се малку во бројки и ретко се распоредени и, според тоа, тешко се снимаат со други методи. Апликациите на интерневронски слики вклучуваат определување на селективност на ориентација на подтипови на GABAergic неврони во визуелниот кортекс на глодари 40 и расчленување на функционалните одговори на подтиповите на интерневроните за време на задачите со одложен одговор. 41

Пред неколку години, ние извршивме истовремено снимање и електрофизиолошко снимање за да обезбедиме доказ за директна врска помеѓу соматските сигнали на калциум и стапките на отпуштање кај кортикалните ГАБАергични неврони 32 (Слика 2). Одредени интерневрони, како што се клетките кои брзо изразуваат парвалбумин (ПВ), имаат висок in vivo стапка на отпуштање - до моментална стапка од ∼ 35 Hz кај анестезирани глувци во нашата студија и просечна стапка од ∼ 50 Hz кај будни глувци кои се однесуваат. 42, 43 Од неколку причини, како што е наведено на крајот од овој дел, заклучувањето на времето на индивидуалните акциони потенцијали беше непрецизно во нашата оригинална студија. Како и да е, повеќето ФВ ќелии прикажаа сигнали за флуоресценција кои внимателно ја следеа стапката на отпуштање [Сл. 2 (а)]. Затоа, дури и во случај кога индивидуалните скокови не можеа да се решат, снимањето на калциум може да се користи за да се прочитаат промените во стапката на отпуштање.


Промени во интрацелуларните концентрации на калциум јон во клетките на церебеларните гранули на мутантниот глушец CACNA1A, Leaner, за време на постнаталниот развој

Одржувањето на хомеостазата на калциум јон (Ca 2+) е клучно за нормална функција на невроните. Променетата хомеостаза на Ca 2+ ги попречува сигналните процеси на Ca 2+ и влијае на преживувањето на невроните. Во оваа студија, ние користевме хомозиготни послаби и потресни мутантни глувци, кои носат автозомно -рецесивни мутации во генот што кодира за α формирање пори подединица на CaВ2.1 (P/Q-тип) напонски затворени калциумови канали (VGCC). Глувците послаби покажуваат тешка атаксија и епилепсија, додека глупавите глувци се помалку сериозно погодени. Пократките клетки на малиот гранули (CGC) покажуваат екстензивна апоптотична клеточна смрт која достигнува врв во постнаталниот (Р) ден 20 и продолжува до зрелоста. Интрацелуларен Ca 2+ ([Ca 2+]јас) се опишани концентрации во витки и растреперени клетки на Пуркиниевите глувци, но [Ca2+]јас концентрации не се пријавени за грануларни клетки, најголемата невронска популација на малиот мозок. Користејќи ја ратиометриската боја, Fura-2 AM, ја истражувавме улогата на хомеостазата на Ca 2+ во смртта на CGC за време на постнаталниот развој, демонстрирајќи базална [Ca 2+]јас, деполаризација предизвикана од Ca2+ минливи, и Ca2+ преодни по целосно блокирање на CaВ2.1 VGCC. Од P20 па наваму, базално [Ca 2+]јас нивоата во послабиот CGC беа значително пониски во споредба со CGC од див тип според возраста. Исто така, ги споредивме базалните [Ca 2+]јас нивоа на послаб и див тип CGC до базален [Ca 2+]јас во растурање на CGC. Деполаризацијата предизвикана од калиум хлорид не откри значајна разлика во минливите Ca 2+ помеѓу послабиот и дивиот тип CGC, што укажува на тоа дека иако послабите CGC имаат дисфункционален P/Q-тип VGCC, минливите Ca2+ по деполаризација се исти. Ова сугерира дека другите VGCC ги компензираат дисфункционалните P/Q канали. Ова откритие дополнително беше потврдено со целосно блокирање на CaВ2.1 VGCC користејќи ω-Агатоксин IV-A.

Калциумот (Ca 2+) е сеприсутен гласник за интрацелуларна сигнализација кој е вклучен во сите настани што се случуваат во клетките на нервниот систем. Одржување на интрацелуларен калциум ([Ca 2+]јас) хомеостазата е клучна за нормалната невронска функција, бидејќи промените значително влијаат на опстанокот на невроните. Ние ги проучуваме послабите мутантни глувци, кои носат автозомно -рецесивна мутација во генот CACNA1A, кодирајќи за α1А формирање на под -единица на CaВ2.1 (P/Q-тип) напонски затворени калциумови канали (VGCC). Хомозиготните послаби глувци покажуваат церебеларна атаксија и отсутна епилепсија, почнувајќи веднаш по постнаталниот (Р) 10-12 ден. Постои прекумерна загуба на послаби церебеларни гранулирани клетки (CGC) почнувајќи од P15, што достигнува врв на P20 и продолжува до зрелоста (Lau et al. 2004 Bawa и Abbott 2008). Неколку автозомно доминантни човечки невролошки нарушувања се поврзани со мутации во генот CACNA1A, вклучувајќи семејна хемиплегична мигрена, генерализирана епилепсија со атаксија, епизодна атаксија тип 2 и спиноцеребеларна атаксија тип-6.

Иако е направена значителна работа за да се разјасни [Ca2+]јас концентрации во Пуркиниевите клетки на овие мутирани глувци (Dove et al. 1998), никој не пријавил [Ca2+]јас концентрации во грануларни клетки, кои се најголемата невронска популација на малиот мозок и врвната смрт на грануларната клетка се совпаѓа со почетокот на атаксичниот фенотип. Измеривме базално [Ca 2+]јас како индекс на хомеостаза на калциум во CGC за време на постнаталниот развој и ги спореди резултатите со CGC од друг мутантен глушец, растреперен. Глувците со расипување носат и автозомно-рецесивна мутација во генот CACNA1A, но таа не е на иста локација со послабата мутација, и овие глувци не покажуваат невро-дегенерација како малолетници или млади возрасни лица (Флечер и сор. 1996).

Според Дове и сор. (1998), има 60% намалување на Ca 2+ струите во послабите клетки на Пуркиние, а исто така има и трикратно намалена веројатност за отворање на каналот. Калциумовите канали од типот П придонесуваат приближно 90% од целата клетка Пуркиниева ќелија Ca 2+ струја (Dove et al. 1998), додека во грануларните клетки P/Q-тип претставува 46% од целата клетка Ca 2+ струја (Рандал и Циен 1995 ). Во вториот дел од експериментот, ние го разгледавме минливото Ca 2+ со деполаризација на грануларните клетки со употреба на калиум хлорид и блокирање на струите од типот P/Q со помош на ω-Агатоксин IV-A.

Див тип (+/+), хомозиготна послаба (tg la /tg la ) и хомозиготно треперење (tg/tg) беа користени глувци на вродена позадина C57BL/6. Сите глувци беа одгледувани и сместени во објектот за лабораториски истражувања и ресурси за животни на Универзитетот Тексас А &M. Деталите за послабото управување со глувчето се опишани на друго место (Бава и Абот 2008). Користени се три машки и три женски глувци со див тип и хомозиготни послаби на четири постнатални возрасни групи (P10, P20, P30 и P40), додека споредбата со хомозиготно растурање е направена на P20 и P30. Процедурите за употреба на животни беа одобрени од страна на Тексас А &M Универзитетскиот лабораториски комитет за употреба на животни и спроведени во согласност со Националниот институт за здравствени водичи за грижа и употреба на лабораториски животни (Национален институт за здравствена публикација бр. 85-23, ревидиран 1996 година).

Клетките на гранулите на малиот мозок беа акутно изолирани и протоколот беше потврден со различни експерименти како што е детално опишано на друго место (Бава и Абот 2008). Накратко, на одредена возраст, глувците беа анестетизирани со употреба на изофлуран и убиени со обезглавување. Малиот мозок беше отстранет, исечен на мали парчиња и префрлен на 50 ml разладен минимален основен медиум со соли на Ерл (MEM Life Technologies Inc., Rockville, MD), потоа префрлен во МЕМ кој содржи 1,5 U/ml протеаза (Сигма, Сент Луис , МО, САД), и промешано. За време на мешањето, 0,2% ДНаза (Сигма) беше додадена за да се вари геномската ДНК ослободена од оштетените клетки. Медиумите што содржат ќелии беа центрифугирани на 1.000е 10 мин, а клетките беа повторно суспендирани во МЕМ.

За базално [Ca 2+]јас мерењата, акутно изолираниот CGC беа обложени на коморни слајдови (VWR, West Chester, PA, USA) и инкубирани на 37 ଌ 20 минути со 95% O2 и 5% СО2На Десет микролитри од 20% плуронска киселина (Сигма) беа додадени на 50 μg на Fura-2 AM и беа додадени во медиумите за да се постигне конечна концентрација од 5 μM. Cелиите беа инкубирани со Fura-2AM на 37 и#x000b0C за 30 мин. Дестестерификацијата на бојата беше извршена со миење на клетките двапати со свеж МЕМ и инкубирање на 37 и#x000b0C дополнителни 30 мин. По деестерификацијата, CGC беа чувани во медиум без фенол црвена боја (Сигма). Fura-2AM го менува интензитетот на флуоресценција различно на бранови должини на возбуда од 340 и 380 nm при врзување на Ca 2+. Клетките беа изложени на двојна ексцитација на 340 и 380 nm и флуоресценцијата беше следена на 510 nm. Флуоресцентни слики се добиени со помош на UV & 40 × објективи на микроскоп Олимп 1X-70 и камера со три чипови Хамамацу ORCA-ER со разладено полнење. Беа спроведени негативни и позитивни контроли за да се потврди експерименталниот дизајн како што е опишано во Бава и Абот (2008).

По мерење на базалните [Ca 2+]јас, констатиравме како CaВ2.1 калциумови канали кај послабите глувци се однесуваат кога се деполаризирани. Минливите Ca2+ беа евоцирани со деполаризација предизвикана од KCl ​​и беа сликани со употреба на Fura-2AM. Користени се пет глувци од див тип и пет послаби глувци. По мерење на базалните [Ca 2+]јас како што споменавме погоре, екстрацелуларниот KCl беше зголемен на 40 mM со суперфузија на гранулирани клетки со 20 μl од 1 mM KCl. K+ индуцираните минливи Ca2+ беа измерени 10 мин., А податоците покажуваа врв [Ca2+]јас се користеа за споредба со почетните базални нивоа. Податоците се изразени како врв [Ca 2+]јас минус почетниот базален [Ca 2+]јас нивоа, што се нарекува калциум минлив. Анализирани се минимум 3 𠄴 клетки од секое животно за секоја возрасна група и генотип.

Да се ​​демонстрира целокупниот процент на CaВ2,1 струја во послаби гранулирани клетки користевме специфичен CaВ2.1 блокатор на канали, ω-Агатоксин IVA (Peptide International, Louisville, KY). Акутно изолираниот CGC од P20 диви и послаби глувци беа натоварени со Fura-2AM. Клетките потоа се инкубираат во 200 nM ω-Агатоксин IVA 20 минути на собна температура, потоа деполаризиран со KCl. Врв [Ca 2+]јас пост -деполаризација е снимена, а податоците се изразени како врв [Ca2+]јас минус почетниот базален [Ca 2+]јас и се нарекува минлив калциум.

Снимање слика и Р-вредностите се пресметани со помош на Simple PCI Version 5.0.0.1503 Compix Inc. и Imaging System (Cranberry Township, PA). [Околу 2+]јас е одредено со равенката:

Позадината беше одземена од 340 и 380 интензитет на флуоресценција пред да се пресмета Р-вредност. Фмин и Фмакс укажуваат на интензитет на флуоресценција на 380 nm во отсуство на Ca 2+ и висок Ca 2+, соодветно. Рмин и Рмакс претставуваат сооднос на F340/380 во отсуство на Ca 2+ и високо Ca 2+, соодветно. Вредностите што се користат за Фмин/Фмакс, Рмин, и Рмакс беа 8,36, 0,2 и 8,47, соодветно, пресметани со помош на комплетот за калибрација на калциум (Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA).

Податоците се претставени како средство и#x000b1 стандардна грешка на просекот. Сите податоци беа анализирани со статистички софтвер SPSS (верзија 12.0.1 за прозорци) со употреба на општ линеарен модел (GLM)-униваријатна анализа на варијанса (ANOVA) на α = 0,05. Значајните разлики меѓу генотиповите беа интерпретирани со помош на пост-хок тестот на Туки за ХСД.

Средно базално [Ca 2+]јас податоците во CGC за време на постнаталниот развој се прикажани на сл. 1. GLM-униваријантна ANOVA посочи целокупна значајна разлика помеѓу генотиповите и постнаталните денови (П < 0.001). Нема значајна разлика во базалните [Ca 2+]јас беше забележано помеѓу див тип и послаб CGC на P10, додека базалниот [Ca 2+]јас на дивиот тип CGC во P10 беше значително намален во споредба со P20, P30 и P40 CGC од див тип. Ова може да се должи на развојниот израз на различни VGCC и нивните под -единици, од изразување на α и β подединици на CaВ2.1 Ca 2+ канал е најочигледен по P10, и нивната заедничка експресија е потребна за правилна функционалност на каналот (Tanaka et al. 1995). Почнувајќи од P20, имаше намален базален [Ca 2+]јас кај CGC на послаби глувци во споредба со CGC див тип според возраста (П < 0.001). Овие наоди се во контраст со витките клетки на Пуркиние, каде што базалните [Ca 2+]јас нивоата не се разликуваа од клетките Пуркиниеви од див тип според возраста (Дове et al. 1998). Ние шпекулираме дека оваа разлика може да се должи на различен тип на Ca 2+ канали присутни во CGC во споредба со Пуркиниевите клетки во кои 90% од струјата на калциум зависи од P/Q-тип VGCC. Повеќекратни VGCC се присутни во CGC кои би можеле различно да реагираат кај послабите глувци како форма на функционална компензација и да резултираат со изменета хомеостаза на Ca2+ и намалена базална [Ca2+]јас.

Средно базално [Ca 2+]јас во клетките на малиот гранул (CGC) за време на постнаталниот развој. Графиконот покажува средно базално [Ca 2+]јас податоци од изолирани CGC од диви (диви), послаби (Leaner) и растреперени (Tottering) глувци (н = 6). Базалниот [Ca 2+]јас нивото кај диви типови CGC беше значително повисоко отколку што беше забележано кај послабиот и растреперен CGC на P20 и P30 (П < 0.001). Исто така, имаше значителни разлики помеѓу диви и витки базални [Ca 2+]јас на P40 (П < 0.001). Сепак, нема значајна разлика во базалните [Ca 2+]јас беше забележан помеѓу див тип и послаб CGC на P10. “*” укажува на значителни разлики помеѓу дивиот тип и другите генотипови и “#” укажува на значителни разлики во групите глувци од див тип. Податоците беа анализирани со употреба на GLM-униваријатна анализа на варијанса на α = 0.05

Интересно е тоа што CGC на растреперени глувци, исто така, покажа намален базален [Ca 2+]јас нивоа во споредба со CGC од див тип (П < 0.001) и нивото не беше различно од послабиот CGC (П = 0,376). Бидејќи превртливото CGC на глувчето не покажува прекумерна смрт на невронските клетки, ова сугерира дека намален базален [Ca 2+]јас сам не е директно одговорен за смртта на невронските клетки кај послабиот CGC. Затоа, ние ги разгледавме минливите предизвикани од деполаризација на Ca 2+ во CGC за време на постнаталниот развој.

Деполаризацијата предизвикана од KCl ​​најчесто се користи за набудување на минливи Ca2+ во CGC. Беше спроведен контролен експеримент за да се види дали набудуваните промени во флуоресцентниот интензитет се должат на екстрацелуларниот прилив на Ca 2+. Изолираните CGC беа натоварени со Fura-2AM и беа деполаризирани со употреба на KCl и во присуство и отсуство на екстрацелуларен Ca 2+ во медиумот. Значително зголемување на [Ca 2+]јас беше забележано во гранулирани клетки и од диви тип и од послаби глувци деполаризирани со KCl во присуство на екстрацелуларен Ca 2+, додека значајно зголемување не беше забележано кај медиумите без Ca2+ (податоците не се прикажани). Временскиот тек на промена во [Ca 2+]јас по деполаризацијата на CGC со KCl се прикажани две фази. Првата фаза беше минлив врв, што претставуваше влез на Ca 2+ во клетките преку канали Ca 2+ и, најверојатно, предизвикано од калциум ослободување на калциум од интрацелуларните резерви. За време на втората фаза (т.е. фазата на платото), [Ca 2+]јас достигнува рамнотежа како резултат на континуирана деполаризација и континуирано тампонирање (Werth and Thayer 1994). Нашето експериментално поставување ги покажа и двете фази на деполаризација на Ca 2+ (податоците не се прикажани). Бевме заинтересирани само за првата фаза, минливиот калциум, кога имаше врв [Ca2+]јас да се разбере ефектот на послабата мутација врз цела ќелија Ca 2+ струи во CGC.

Општа линеарна модел-униваријатна анализа на ANOVA не покажа разлика во минливите Ca2+ помеѓу генотипови во сите возрасни групи. Имаше значителна разлика во минливите Ca2+ кај C10 од див тип P10 во споредба со CGC од глувци од див тип P20, P30 и P40 (Слика 2). Развојните промени забележани во струјата на Ca 2+ се релевантни за процесите на созревање и ексцитабилност на грануларните клетки. Нашиот резултат е во согласност со голем број докази кои сугерираат дека струите на Ca 2+ се пониски во незрелите гранулирани клетки (Рандал и Циен 1995). Кај P10, послабиот CGC ја покажа истата шема како P10 CGC од див тип, освен, за разлика од CGC од див тип, послабиот CGC не покажа разлика во минливите Ca2+ помеѓу P10 и P20 (Слика 2). Ова сугерира или одложено созревање на CGC или развојни дефекти поради CaВКаналска мутација од 2,1 тип кај послаби глувци.

Средни минливи премини на калциум во клетките на малиот гранул (CGC) на глувци од див тип (Диви) и послаби (Leaner) за време на постнаталниот развој. Графикон покажува просечни минливи податоци за Ca 2+ во послаби и диви типови CGC откако тие беа деполаризирани со употреба на 40 mM KCl. Анализирани се минимум 3 𠄴 клетки од секој глушец за секоја возрасна група и генотип. Немаше значајни разлики помеѓу дивиот тип и послабиот CGC за сите возрасни групи забележани. Меѓутоа, минливите Ca2+ во C10 од див тип P10 беа различни од целата група на див тип (“*”, П < 0.05) и Ca 2+ преодни кај P10 послабиот CGC беа различни од P30 и P40 (“ ** ”, П < 0,05). Податоците беа анализирани со употреба на GLM-униваријатна анализа на варијанса на α = 0.05

Нашите резултати сугерираат дека иако послабиот CGC има дисфункционален CaВ2.1 калциумови канали сепак нема голема промена во целокупните минливи Ca2+ помеѓу дивиот тип и послабата CGC пост-деполаризација. Ова значи дека или постои можна функционална компензација од други VGCC за дисфункционален CaВ2,1 канали или намален тампон Ca 2+ во CGC, така што зголеменото [Ca 2+]јас се јавува кај послабиот CGC не е ефикасно бафериран, што доведува до зголемени минливи Ca2+. Друга можност е присуството на двата гореспоменати механизми. Претходно забележавме намален израз на калетинин, главниот протеин за врзување на Ca 2+, во послаб CGC во споредба со грануларните клетки од див тип според возраста (Nahm et al. 2002). Намалениот израз на калетинин во витките гранулирани клетки може да го преувеличи одговорот на индуциран од К + [Ca 2+]јас зголемување поради помалиот тампон капацитет Ca 2+. Друго толкување може да биде тоа CaВ2.1 Ca 2+ канали не придонесуваат за голем дел од целата ќелија Ca 2+ струја во послабиот CGC. За да ја тестираме оваа хипотеза, ние го деполаризиравме CGC во присуство и отсуство на специфичниот CaВ2.1 блокатор на канали, ω-Агатоксин IV-A, за кој е познато дека ги блокира и струите Ca- 2 од типот P- и Q-тип врз основа на различна кинетика на инактивација и чувствителност (Рандал и Циен 1995).

Резултати со користење ω-Агатоксин IV-A покажа значително намалување од скоро 40% во деполаризацијата предизвикана од Ca 2+ минливи кај CGC на P20 диви тип глувци. Нашите податоци се согласни со претходниот извештај дека приближно 45% од тековната Ca 2+ во CGC може да се пресмета со CaВ2.1 VGCC (Рандал и Циен 1995). Меѓутоа, ω-Агатоксин IV-A не беше во можност значително да ги намали минливите на Ca 2+ предизвикани од деполаризација кај послабиот CGC (Слика 3). Иако, имаше 17% намалување на преодните третирани со агатоксин цела клетка Ca 2+ кај CGC на послаби глувци, одговорот не беше значително различен од минливите на Ca 2+ третирани со неагатоксин. Ова сугерира дека постои функционална компензација за CaВ2.1 калциумови канали од други VGCC.

Средниот Ca 2+ ги пренесува податоците од послабите и дивите типови на церебеларни гранули (CGC) откако биле инкубирани во присуство или отсуство на ω-Агатоксин IV-A и деполаризиран со KCl. Намалени минливи Ca 2+ беа забележани само кај диви (Диви), но не и во послаби (Leaner) CGC по инкубација со CaВ2.1 канален специфичен блокатор ω-Агатоксин IV-A (П < 0,05 н = 30). Податоците беа анализирани со употреба на GLM-униваријатна анализа на варијанса на α = 0.05

Видови канали кои компензираат за дисфункционален CaВ2.1 канали во послаб CGC не се познати. Невроните на ЦНС обично имаат разновидни подтипови на канали Ca2+ кои се преклопуваат во функција. Неодамна, Етергеј и сор. (2007) објави функционална зголемена регулација на CaВ1 (L-тип) канали за да се компензира намаленото CaВФункција од 2,1 канали во базалните неврони на предниот мозок од послаби глувци. Како и CGC и за разлика од Пуркиниевите клетки, основните неврони на предниот мозок поседуваат целосен комплемент на подтипови на канал Ca2+ (Etheredge et al. 2007). Слично на тоа, CaВСе покажа дека 2,2 канали (од типот N) ја компензираат намалената функција од типот Р кај глупавите глувци (Leenders et al. 2002). Калциумовиот канал од типот Т α1G се покажува дека подединицата е различно регулирана кај витките мали мозочни клетки Пуркиние и гранули (Нам и сор. 2005). Додека церебеларна Пуркиниевите клетки покажуваат зголемен α1G израз на подединица, CGCs покажуваат намален α1G израз на подединица (Nahm et al. 2005). Така, се чини дека генетската промена во CaВ2.1 Каналите Ca 2+ предизвикуваат различни последици во изразот и функциите на каналот Ca 2+ на церебеларниот Пуркиниев и грануларните клетки.

Како заклучок, за првпат известуваме за базална и деполаризација предизвикана [Ca2+]јас во CGC на послаби глувци користејќи ратиометриска боја Fura-2AM. Нашата студија покажа дека има намален базален [Ca 2+]јас во послабиот CGC, сепак, деполаризацијата предизвикана од Ca 2+ преодни кај послабиот CGC се слични со CGC од див тип што може да се припише, барем делумно, на намаленото тампонирање на Ca 2+ во CGC што беше претходно пријавено (Нам и сор. 2002 година). Сепак, блокирање на целиот CaВ2.1 Ca 2+ канали не ја намалија струјата на целата ќелија, што укажува на функционална компензација од други VGCC. Идните истражувања во оваа област ќе бидат разјаснување на VGCC кои компензираат за дисфункционален CaВ2.1 Ca 2+ канали во CGC на послаби глувци.


Ефекти на FK506 и Циклоспорин А врз митохондријална деполаризација предизвикана од калциум и цитосолен калциум кај астроцити и неврони

Оваа студија ја тестираше хипотезата дека чувствителноста на загубата на потенцијалот на митохондријалната мембрана предизвикана од Ca 2+ (Δ Ψm) и чувствителноста на загубата на инхибиторите на митохондријалната транзиција на порите (ПТП) се различни за неврони и астроцити. Примарните култури на кортикални неврони на стаорци и астроцити беа изложени на Ca2+ јонофор 4-Br-A23187 и Δ Ψm беа следени со флуоресцентна сонда тетраметилродамин метил естер (TMRM). Ca 2+ јонофор предизвика пад на Δ Ψm кај двата типа на клетки што беше делумно инхибиран од циклоспорин А (CsA) кај астроцитите, но не и кај невроните. Друг инхибитор на ПТП, 2-аминоетокси-дифенилборат, беше неефикасен во заштитата од митохондријална деполаризација, но деполаризацијата беше инхибирана со FK506, имуносупресивен лек сличен на CsA кој не го инхибира PTP. CsA и FK506 значително го намалија зголемувањето предизвикано од јонофор во [Ca2+]јас и во невроните и во астроцитите. Заклучуваме дека заштитните ефекти на CsA и FK506 против деполаризацијата на митохондријалната мембрана предизвикана од Ca 2+ во непроменети астроцити не се должи на инхибиција на ПТП, туку е веројатно последица на инхибиција на порастот на [Ca 2+]јас.


Материјали и методи

Хетеролошка експресија на HCN канали. Човечки HCN4 субклонирани во ХинdIII/XbaВеб -страниците во pcDNA1.1/Amp векторот беше великодушно обезбеден од U. B. Kaupp (Forshungszentrum Julich, Германија). HEK293 клетките се одгледуваат во DMEM, дополнети со 10% FBS, 100 единици/ml пеницилин и 100 μg/ml стрептомицин. Кога клетките се приближиле кон сливот, тие биле засадени во садови од 35 мм и последователно биле трансфектирани со HCN плазмидот со употреба на метод на калциум фосфат. HCN4 беше котрансфектиран со GFP за да го води изборот на клетки што изразуваат HCN канали. По 48-96 часа, трансфектираните клетки со зелена флуоресценција беа избрани за експерименти со лепенка за стегање.

Клеточна дисоцијација. Адреналните хромафински клетки од стаорци Вистар (SLACCAS Inc., Шангај) беа изолирани и култивирани како што е опишано (26, 27). Клетките се користеа во експериментите по 2-6 дена во културата.

ДРГ невроните беа изолирани како што е опишано со мала измена и се користат 4-16 часа по подготовката (28). Користевме неврони со мала до средна големина (25-40 μm).

Употребата и грижата за животните користени во оваа студија беа во согласност со упатствата на Советодавниот комитет за истражување на животните на Шангајските институти за биолошки науки.

Електрофизиологија. Јонските струи беа проучувани во конфигурацијата на целата ќелија под стегач со напон со помош на засилувач EPC-9 (HEKA Electronics, Ламбрехт/Пфалц, Германија). За префрлување надворешни решенија, ние користевме систем за перфузија RCP-2B, кој има брзо размена на време (100 ms), контролирана електронски помеѓу седум канали (Инбио, Вухан, Кина ref. 28).

Решенијата што се користат за експерименти се сумирани во табелите 1 и 2. Отпорноста на пипета беше 2-5 MΩ за клетките на човечкиот ембрионален бубрег (HEK), невроните на ДСГ и клетките на надбубрежните хромафини.

Состав на внатрешни решенија* (во мм)

Експериментите за калибрација на флуоресценција беа изведени во сферични надбубрежни хромафински клетки, со дијаметар од 12-15 μm. Интрацелуларен раствор кој содржи висок CsCl (види Табела 1) се користеше за мерење на Ca 2+ струи со напон.

Мерењата на капацитетот на мембраната беа извршени со софтверски засилувач за заклучување на пулсовиот софтвер кој го контролира засилувачот EPC-9 (HEKA Electronics ref. 28). Симулирани акции потенцијални рафали за стимулација беа конструирани од компјутер од шаблон за потенцијален акција, кој беше однапред снимен од невронот на ДСГ под моменталната стегалка. Овој акционен потенцијал (АП) -стимулациска бранова форма беше применет на ДСГ невроните под целото клеточно напонско стегање.

DMEM и FBS беа купени од GIBCO. Солта Фура-2 е од Молекуларни сонди. Сите други хемикалии беа од Сигма. Сите експерименти беа спроведени на собна температура (22-24 ° C).

Мерења на флуоресценција и теорија на фракционо Ca 2 + Мерења. Интрацелуларен калциум ([Ca 2+]јас) беше измерено со користење на систем за сликање Ca 2+ (TILL Photonics, Planegg, Германија). Фура-2 (0,1-1,0 мМ) беше вчитана во ќелијата преку печ-пипета во конфигурацијата на целата ќелија. Флуоресценцијата беше земена мостра со фреквенција од 1 Hz (28).

Фракционо Ca 2+ струја, Пф, се дефинира како процент од Ca 2+ струја во вкупната струја што минува низ катјонски канал (да речеме, Јас HCN4 во овој случај). Според првичната дефиниција (6), каде Јас HCN е HCN4 струја, и Јас HCN, Ca е предложениот дробен Јас HCN4 струја што ја носи Ca 2+. ΔFd е промената на Fd, што е „модифициран сигнал за фура -2 чувствителен на Ca 2+“ непосредно пред (Fd') и потоа (Fd″) Наплив на напон предизвикан од Ca 2+ прилив (3), Fd = F340 –F380, ΔFd = Fd″ – Fd′, И ѓ макс е константа, која се одредува со мерење на прилив на Ca 2+ преку калциумови канали со напон, во хромафинските клетки под услов интрацелуларната фура-2 да е доволно висока (& gt0,4 mM) (6). Во физиолошки услови, сите јони што придонесуваат за струјата низ каналите Ca 2+ се Ca 2+ (3), или Пф = 100%. Од Ек.1, ние имаме ѓ макс = ΔFd/(∫Јас Ca дт), каде Јас Ca е струја низ канали Ca 2+ со напон.

За да го снимите временскиот тек на дијализата на фура-2, следете го реф. 6, ние користевме Ca 2+ -независен сигнал за флуоресценција F360, кој може да се пресмета од F340 и F380. F360 = F340 + αF380, каде α е „изоефикасен“ и може да се определи со било какво експериментално снимање што покажува брзи промени во концентрацијата на Ca 2+. Во нашето поставување, α = 0,35. Бидејќи F360 е независен од Ca 2+, може да се користи како показател за интрацелуларната концентрација на фура-2 [фура]јасНа По воспоставувањето на конфигурацијата за снимање на целата ќелија, фура-2 беше дијализирана во ќелијата, и ова беше придружено со пропорционално зголемување на Ф360. Откако F360 достигна ниво на стабилна состојба, претпоставивме дека [фура]јас беше еднаква на концентрацијата на фура-2 во пипетата (види слика 3 и ref. 6).

Протоколи за мерење на прилив на Ca 2+ преку канали HCN4. (А) Ca 2+ сигнали како одговор на деполаризирачки импулси (Б долу десно) во ќелија на хромафин (Ca со напон) 2 + струја, VDCC, Право) и до хиперполаризирачки импулси (Б долу лево) во ќелија HEK293 која изразува HCN4 (HCN, Лево). Ca 2 + сигнали за време на вчитување на фура-2 (1 мМ во пипетата) F360 (горните траги, што укажува на влегување на фура-2 во ќелијата), F380 (средни траги, што укажува на прилив на Ca 2+) и [Ca 2+]јас (траги од дното) се прикажани. Испрекинатите линии се основни. (Б) Ca 2+ струја (Право) и Јас HCN4 (Лево) со соодветните Fd (врвни траги). Fd промени предизвикани од протоколите за напон (Дното) се прикажани како ΔFd1 и ΔFd2 за HCN4 и VDCC, соодветно. Испрекинатите линии во тековните траги укажуваат на нула. Засенчените области го означуваат вкупниот полнеж на јонскиот прилив низ каналите. (В) Одредување на фракционата Ca 2+ струја преку HCN4 канали. ΔFd1 за HCN4 и ΔFd2 за VDCC се заверени против јонскиот прилив. (Влегување) Равенката што се користи за пресметување Пф (види Материјали и методи). (ГВо споредба со VDCC (Пф = 100%) во клетките на хромафинот (3), на Пф на HCN4 е 0,60 ± 0,02% (н = 7).

Според Ек. 1, со мерење на сигналот на фура-2 предизвикан по активирање на Јас HCN4 во ќелиите HEK293 што изразуваат канали на HCN, Пф на HCN каналите може да се одреди.

Интрацелуларна бесплатна концентрација на Ca 2+, [Ca 2+]јас, беше измерено според Гринкевич и сорНа (29): [Ca 2+]јас = К еф·(РР 0)/(Р 1Р), каде Р 0 = 0.1, Р 1 = 3,4, и К еф = 1938 nM, како што е определено со стандардни калибрации (29, 30).

Податоците беа анализирани со софтвер igor pro -3.12 (WaveMetrics, Lake Oswego, OR). Освен ако не е поинаку наведено, податоците се претставени како средна вредност ± СД. Статистичкото значење беше тестирано со Студент т тест. П & lt 0,05 се сметаше за статистички значајна.


Дискусија

Скрининг со висока пропусност доведе до минијатуризација на анализите и адаптација за скрининг на голем број соединенија во напорите за откривање и развој на лекови. Меѓу функционалните техники за анализа за таков скрининг, флуоресценцијата привлече големо внимание доцна (16, 18-22). Најшироко користени флуоресцентни сонди за функционална анализа на никотински рецептори се флуо- и фура-боите за калциум хелати развиени од Циен (39-41). Бојата за калциум што се користи во оваа студија е слична по природа со боите со интензитет Флуо-3,4, освен што секундарна боја е вградена за да ја маскира флуоресценцијата во позадина поради истоварена и екструдирана боја (31). Оваа боја за маскирање ја елиминира потребата за миење на екстрацелуларната боја, со што се поедноставува анализата и се зголемува репродуктивноста.

Сегашните методи овозможуваат брз скрининг на соединенијата за евалуација на структурата-активност и специфичноста на подтиповите за никотинските рецептори. Инструментот со 96 бунари што се користи во тековната студија има интегриран модул за флуидика што ги испушта реагенсите за време на добивање сигнал. Може да се програмираат до три додатоци, што овозможува да се тестираат стекнување одговори од соединението, референтен агонист и калибрант. Овој протокол овозможува да се процени агонистичката и антагонистичката активност во рамките на истиот експеримент, бидејќи агонистот ќе произведе почетна реакција на флуоресценција, додека антагонистот нема. Сепак, и двете ќе предизвикаат инхибиција на последователна стимулација на никотин. Инхибицијата забележана за никотински агонисти може да резултира од десензибилизација или блокада на отворени канали (27-30). ЕЗ50 и ИЦ50 вредностите за агонистите беа слични по големина во клетките KXα3β4R2, KXα4β4R1 и ​​TE-671. Во ќелиите IMR-32, SH-SY5Y и K-177, IC50 вредностите за инхибиција на никотинскиот одговор од страна на цитизин беа значително повисоки од ЕК50 вредности за активирање на цитизин. Интересно, клетките на KXα4β2R2 бараа пониски концентрации за инхибиција на никотинскиот одговор отколку за активирање од сите четири агонисти (Табела 3). Потребни се дополнителни кинетички студии за да се откријат причините за таквите резултати, бидејќи одговорите на агонистите честопати не беа целосно распаднати пред последователното додавање на референтниот агонист, никотин. Додека фармаколошкото толкување на кривите на инхибиција за агонистите не е јасно, тие може да послужат како дијагностичка алатка за никотинска активност. Во случај на антагонисти, параметрите на инхибиција ќе зависат од механизмот и временскиот тек на блокадата.

Тековната парадигма обезбедува кинетички податоци и овозможува проценка на агонизмот и антагонизмот во рамките на истиот експеримент. Употребата на бои за кои не е потребно перење ја намалува варијабилноста поради одвојување на клетките. Конечно, употребата на автоматски читач на плочи/течни ракувачи ја зголемува репродуктивноста на додатоците. Мембранската потенцијална анализа изгледа многу почувствителна од анализата на флуоресценција на калциум, но дава податоци согласни или со флуоресценција на калциум или со анализи на ефлукс од 86 Rb (Табела 2 и Слика 4).

Иако мерењето на флуоресценција на активноста на никотинските рецептори преку динамика на калциум е документирано опсежно во последниве години (16, 18-20, 31), употребата на мембранскиот потенцијал за никотински рецептори е нова и доста чувствителна. Употребата на мембранскиот потенцијал е особено важна за клеточните линии кои минуваат малку или без калциум. ТЕ-671 клетките, кои го изразуваат невромускулниот подтип на никотински рецептор (8), имаат ниска спроводливост и експресија на калциум. Навистина, не бевме во можност да добиеме значителен одговор на калциум с well до минатото спојување на клетките, а потоа само слабо. Слаби сигнали за калциум беа исто така забележани со К-177 клетки што изразуваат човечки α4β2 рецептори, и со SH-SY5Y и IMR-32 клетки, изразувајќи ги човечките ганглионски рецептори подтипови. Не можеше да се забележат сигнали за калциум со KXα4β2R2 и KXα4β4R1 (податоците не се прикажани). Мембранскиот потенцијал, сепак, дава прифатливи сигнали во сите клеточни линии што се користат овде и многу силни сигнали во неколку.

Мембранската потенцијална флуоресценција, иако обезбедува дополнителни податоци за флуоресценција на калциум и ефлукс од 86 Rb, не обезбеди идентични податоци. Агонистите беа конзистентно и значително посилни во анализата на потенцијалот на мембраната, додека антагонистите беа помалку потентни. Покрај тоа, потенцијата на мекамиламин во клетките KXα3β4R2 беше ≈20- до 40 пати помала отколку во клетките IMR-32 или SH-SY5Y, иако се смета дека овие клеточни линии изразуваат слични никотински рецептори од ганглионски тип. Функционалните одговори во IMR-32 клетките се припишуваат главно на α3β4 рецептори врз основа на електрофизиолошки мерења (35). IMR-32 и SH-SY5Y клетките го изразуваат рецепторот на & lt100 fmol/mg протеин (23, 37), додека KXα3β4R2 клетките ги изразуваат рецепторите на ≈8.000 fmol/mg протеин (25). Можно е разликите во потенцијата да се должат на разликите во барањата за активирање на фракциони рецептори за деполаризација на мембраната. Овој механизам исто така може да ги објасни разликите во потенцијата помеѓу анализите на потенцијалот на калциум и мембрана за антагонисти. Во случај на агонисти, можно е само мал дел од рецепторите да се активираат за да се деполаризира мембраната (фракцијата зависи од бројот на рецепторите), што резултира со зголемена очигледна моќ. Спротивно на тоа, антагонистите би требало да инхибираат многу поголем дел од рецепторите за да спречат деполаризација, што резултира со намалена очигледна потенција. Ова е потенцијално важно набудување, бидејќи таквите деполаризации дејствуваат како предизвикувачки настан за отворање на јонски канали со напон и други процеси зависни од потенцијалната мембрана.